下面是范文网小编整理的分子生物学岗位职责4篇(对分子生物平台岗位的理解)，以供借鉴。
分子生物学岗位职责1
分子生物学实验
1.幸免长时刻的培养，大肠杆菌一样培养12个小时就能够挑取克隆子进行验证了。
要紧是因为培养时刻过长，专门是含有Amp抗性的质粒。重组菌能够分泌酶降解Amp，造成平板中局部Amp浓度太低。其他未重组菌在Amp存在的情形下只是生长受抑制而非死亡，当Amp浓度降低时就能够生长了。卫星菌落，由于阳性菌落大量分解抗生素，造成周围区域抗生素浓度降低，则无抗性的菌也生长出来了。一句话，你的板子培养时刻过长了。这是amp抗性质粒特有的卫星菌落，确实是又抗性的E col分泌beta内酰胺酶分解周围的amp，从而使没有抗性的e coli生长。
乙醇能够排除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na＋之类的平稳离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。1.什么原因用无水乙醇沉淀DNA？
用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是能够任意比和水相混溶，乙醇与核酸可不能起任何化学反应，对DNA专门安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳固存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一样实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。然而加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA缺失也增大，专门用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也能够用倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一样在室温下放置15－30分钟即可。
2.在用乙醇沉淀DNA时，什么原因一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达～/L？
在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，如此就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其成效也不行。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，阻碍DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是能够任意比和水相混溶，乙醇与核酸可不能起任何化学反应，对DNA专门安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳固存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一样实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。然而加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA缺失也增大，专门用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也能够用倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一样在室温下放置15－30分钟即可。1。DNA不溶于乙醇
2。乙醇能够吸附水分子（极性相同），使得溶液中相对的水分子减少，增大了DNA在水中的相对浓度。
3。附：乙醇沉淀DNA需要盐离子，用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才能沉淀完全。
4.溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。
溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的爱护作用，最终使细菌溶解死亡。也能够直截了当破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这要紧是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁要紧是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中能爱护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还能够使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还能够促进蛋白质的消化吸取
5.酚、氯仿是变性蛋白质的（由于苯酚能溶进少量水缺失DNA，因此与氯仿一起使用，减少DNA缺失）
异戊醇是消泡剂（蛋白质变性中常常产动气泡，会缺失DNA，因此需消泡）抽提DNA去除蛋白质时，如何样使用酚与氯仿较好？酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。通过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而缺失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚成效好，但氯仿与水不相混溶，可不能带走DNA。因此在抽提过程中，混合使用酚与氯仿成效最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，现在一起将酚带走。也能够在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
10．什么原因用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合平均，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产动气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，因此能减少抽提过程中的泡沫产生。一样采纳氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采纳酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相坚持稳固。1.酚/氯仿/异戊醇的作用：从核酸样品中除去蛋白质经常常使用酚和氯仿都能使蛋白质变性，并使其溶于有机相或中间相内，而异戊醇则有助于排除抽提过程中显现的气泡。
6.β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,幸免褐变,使酚容易去除
7.
8.讲得对。75%乙醇清洗DNA的目的是脱盐的。
其机理如下：75%乙醇中含有25%的水，这部分水能够溶解和DNA沉淀中混有的、DNA沉淀前加入的钾盐（或钠盐），但同时也会溶解（缺失）少部分DNA（盐离子比DNA更易溶于水中）。为了减少DNA缺失，因此用含量较高的乙醇溶液（DNA不溶于乙醇）。蛋白质、糖、脂类等都能够溶于75%酒精，而DNA不溶
9.
A的作用是使RNA降解，减少提取得到的DNA中的RNA，以便减少对后续实验的阻碍。RNaseH是一种逆转录酶。消化mRNA用的。RNase H，即Ribonuclease H，中文名为核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，能够特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。RNase H不能水解单链或双链DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链DNA或RNA。
特点：特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA，常用于cDNA第二链的合成编辑本段用途
· 在cDNA第二链合成前去除mRNA
· DNA-RNA杂交体的鉴定
· 在Oligo(dT)存在下去除mRNA 的poly(A)尾
11.当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。破细胞的要紧是碱，而不是SDS，因此才叫碱法抽提。 N NaOH：是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌依旧哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬时就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。由于质粒和细菌染色体的拓扑结构不同，变性时前者尽管两条链分离，却仍旧缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至显现断裂。因此，在裂解细菌时要注意：
第一，时刻不能过长，因为在如此的碱性条件下DNA片断会慢慢断裂；
第二，混合必须轻柔，不然DNA也会断裂。
1% SDS（十二烷基磺酸钠）：是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
12.这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀。当加入的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值复原较低的近中性水平常，质粒的两条小分子单链可迅速复性复原双链结构，然而主染色体DNA则难以复性。
SDS遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾（potaium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶于水的，而高浓度的盐使得沉淀更完全。SDS极易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。
同时，尽管SDS并不与DNA分子结合，由于大肠杆菌的基因组DNA专门长，专门容易和变性的蛋白质缠绕在一起。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，变性蛋白质等缠绕一起被沉淀，而复性的质粒DNA以可溶性状态留在上清夜中。
13.所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原先认识序列不同的位点的现象，也确实是讲产生Star活性后，不但能够切断特异性的识别位点，还能够切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。
因此讲Star活性与粘端变平端没关系。另外，Star活性除了与酶本身的性质有关外，与甘油浓度，pH值及离子浓度有关。
一样正规厂家生产的限制酶出厂前都做有关的检测，buffer体系也都做了相应的考虑。因此正常情形下酶切，能够先不必考虑Star活性的咨询题。
一旦显现底物DNA不行切断，需要增加酶量或延长反应时刻时，如果使用的是易产生StaR活性的限制酶切，一样优先考虑增加酶量，而不是延长反应时刻，换句话讲，延长时刻比增加酶量更易产生Star活性。
另外，实际上几乎所有的限制性内切酶都可能产生Star活性。但目前Star活性对实际实验室操作过程中的阻碍并不太大，能够先不考虑。一样来讲，限制性内切存在严格的识别在序列特异性，但某些条件改变，会使其对识别序列特异性的放宽，而导致在DNA内产生附加切割，限制性内切酶表现的这种活性称为星活性，或第二活性，在名称右上角加一星号表示。
产生星活性的条件 ①甘油浓度
②离子强度 高盐缓冲液酶降低盐 ③pH值 ～8．5产生
④有机溶剂 DMSO(二甲亚砜)1～2%(V/V)
⑤二价阳离子Mn2+代替Mg2+
⑥酶与DNA的比例
酶与DNA比为(50U／μg)产生星活性。为了防止星活性的显现，所有限制性内切酶反应在标准条件下(专门是pH、离子强度、二价离子浓度的条件下)进行。
某些限制性内叨酶诱导产生星活性的反应条件
酶 诱导星活性条件
AvaI A,B,D
EcoRI A,B,D,E,F
HaeⅢ B,D
HhaI B,D,G
BamHI A,B,C,D,E,H
A．乙二醇(45％)；B.甘油(11～20％)；C.乙醇(12％)； D．高酶：DNA比值()25U／μg)；E．Mn2+代替Mg2+； F．pH8．5；G．DMSO(8％)；H．无NaCl
14.同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是专门重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的讲明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可按照每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时刻。要保证双酶切实验的高效、准确，就要选择合适的通用buffer。如此就能幸免质粒和基因没有切动或者被切散。常用的几家内切酶公司有MBI、NEB、Promega、Roche、Takara，要查找双酶切体系的通用buffer，最好到出品该内切酶的公司网站上查询。15.缓冲液在电泳过程中的一个作用是坚持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反应，正极发生的是氧化反应（4OH--4e->2H2O+O2)，负极发生的是还原反应（4H++4e->2H2)，长时刻的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，是溶液两极的pH保持差不多不变。
电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一样电泳缓冲液中应含有/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。
电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。
16.
17.关于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决方法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易辨论，造成条带缺失现象。孔径大的琼脂糖。
19.⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油储存的菌种中直截了当转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用差不多过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600操纵。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一样应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。同时受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。⑵、质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应要紧是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范畴内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一样地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。关于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将专门难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也紧密有关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。
⑶、试剂的质量
所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯洁的水配制，最好分装储存于4℃。
⑷、防止杂菌和杂DNA的污染
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会阻碍转化效率或杂DNA的转入。
⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
是Tris-乙酸，缓冲容量小，然而溶解度大，易于储存
TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，然而溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀
TAE与TBE的区别
第一要明白 TAE 與 TBE 緩衝溶液的成份如下： 50x TAE Buffer(Tris-Acetate-EDTA)242 gm Tris base
ml Acetic acid 100ml EDTA Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to TBE Buffer(Tris-Borate-EDTA)108 gm Tris base 55 gm Boric acid gm Na4EDTA Add ddH2O to 1 pH is and requires no adjustment.它們的分別有下列幾點：
不能太濃(它只可有 10 times)，因為 borate 會专门容易沉澱，但一样有少許沉澱是不會有太大問題。
的 buffering capacity 比 TAE 高，用 TBE 來跑出來的 gel，辨论率(resolution)會比較高。
3.因為 TBE 有 borate 離子(ion)，它會影嚮酵素(enzyme)的工作。因此，若要為分離出的 DNA 進行下一步酵素處理，如 cloning 或 restriction cut 的話，就要切記不要讓 DNA 碰上 borate ion。
的 buffer capacity 比較差，gel 一样比較模糊，但它不會對影嚮酵素
三种缓冲液的配制方法
Tris-乙酸（TAE）：50×浓贮存液（每升）：
242g Tris 碱 冰乙酸
100ml /L EDTA()
使用时再稀释50倍。
Tris-磷酸（TPE）：10×浓贮存液（每升）：
108g Tris 碱
85％磷酸（ /ml）40ml /L EDTA()
使用时再稀释10倍。
Tris-硼酸（TBE）：5×浓贮存液（每升）：
54g Tris 碱 硼酸
20ml /L EDTA()21.标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液
10ul
4种dNTP混合物
各200umol/L 800ul
引物
各10～100pmol
模板DNA
～2ug
Taq DNA聚合酶
Mg2+
/L
加双或三蒸水至
100ul
PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质要紧有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
、考虑是否引物有咨询题，不特异；2、是否Taq酶加多了，一样50ul体系加1U Taq就能够了；3、是否是Mg2＋加多了，Mg2＋加多了会造成非特异扩增；4、是否退火温度不行？5、是否循环数过多，PCR扩增后期，进入平台期扩增，错误扩增增加，非特异性也增强.23.可能有如下缘故: 1, 模板量过低;
2, 引物浓度多大;3, 退火时刻过长.4, 最重要的一点是,在引物设计过程中幸免引物间有互补序列,专门是3'末端, 同时尽量使引物3'末端的GC含量高一点,使与模板紧密结合.做到以上各点,一样可不能显现引物二聚体了.24.由于RNase能迅速降解RNA，且耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子，用蛋白质变性剂只能使之临时失活，变性剂去除后，其活性又可复原。因此，分离提取RNA时，为确保RNA的完整性，必须制造一个无RNase的环境，操作时应专门注意以下几个方面：
1．操作者在整个实验过程中必须戴消毒手套和口罩，并经常更换。
2．玻璃器皿冲洗洁净后，需180~250℃干烤4小时以上。
3．尽可能使用一次性塑料制品(Ep管、吸头等)，用%DEPC溶液浸泡过夜，80℃烤干后高压灭菌。
4．电泳槽冲洗洁净后，于3%H2O2中浸泡30分钟以上，然后用%DEPC溶液或高压灭菌水完全冲洗。
5．除Tris类试剂外，所有溶液用%DEPC处理12小时以上，然后高压消毒。所用试剂应未开封或RNA专用试剂。
6．使用强烈、有效的RNase抑制剂以抑制内源RNase。常用的RNase抑制剂有异硫氰酸胍（GTC）、氧钒核糖核苷复合物（VRC）、RNasin及焦碳酸二乙酯（DEPC）等。
评判RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性。均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完整的RNA则取决于最大限度地幸免纯化过程中内源性及外源性RNase对RNA的降解。通常采纳紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA 的A260/A280=，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，一样在~之间，低于该值表明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。有时样本的A260/A280可能大于，如重复读数无误，并不表示纯度有咨询题。
RNA的完整性可通过琼脂糖电泳法进行鉴定。完整的RNA电泳时，28S（约）和18S（约）rRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。
提取提取RNA能够分为总RNA，mRNA，Virus RNA（RNA病毒）几类Trizol即异硫氰酸胍-苯酚法，这种方法的原理是：第一用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，开释出核酸。开释出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使DNA和RNA分离开来。进一步通过有机溶剂来抽提沉淀RNA，就能够得到纯洁的RNA；
26.
27.一、防止RNA酶污染的措施
1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时刻。
2.塑料器皿可用% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用% DEPC水冲洗，晾干。
4.配制的溶液应尽可能的用% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经μm滤膜过滤除菌。
5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂
1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不完全的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，能够和多种RNA酶结合，使其失活。
5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 。配1000ml的DEPC处理水，加1mlDEPC。磁力搅拌器搅拌 过夜。翌日 高压蒸汽灭菌 121c，25min DEPC分解成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。最好分装小瓶来用，尽量幸免污染。DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。经检测不含RNase、DNase和proteinase。
DEPC水能够用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无RNase、DNase和proteinase的反应体系。
DEPC水一样是指千分之一浓度的DEPC,在搅拌器上搅拌至完全溶解，即看不到“油珠”为止，用来处理枪头、EP管的DEPC水不需高压灭活，而用于配制DEPC酒精等试剂和用来这种RNA有关试验的DEPC水需灭火后使用。DEPC气味芳香浓烈，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作。
方法是：取市售DEPC 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）。有些试剂 可直截了当加入DEPC，终浓度一样为%～%，原则上在杂交及其往常的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的 稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。
注意：①DEPC是 潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并幸免接触皮肤。②含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。
去离子纯洁水加入DEPC达浓度%，室温下连续搅拌过夜，分瓶包装后湿热高压灭菌完全挥发去除DEPC后能够长期储存在室温或4度冰箱，不宜反复使用。
30.
31.非变性凝胶里面没加变性剂，一样是SDS。非变性胶跑出来的蛋白能保持其活性一样用做功能试验，如EMSA。由于没有变性剂的缘故非变性胶电泳时除了与蛋白分子量有关也会受都电荷的阻碍，因此对蛋白等电点的确定和缓冲液的酸碱性有注意，有时需要倒转电泳时的正负极。从跑的胶来看，变性胶会比较好看，带比较窄，非变性胶跑出来则比较粗糙。
32.[1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液， 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。[2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。[3]使RNA变性（最多20μg），,10×MSE缓冲液20ml，甲醛，去离子甲酰胺10ml。[4]55℃加热15min，冰浴冷却。[5]加2ml5×载样缓冲液。[6]上样、同时加RNA标记物（同位素（32P）dCTP）。[7]60伏电泳过夜。[8]取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。[9]室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。[10]室温下将胶浸到/L Tris HCl()中45min,使胶中和。[11]20×SSC洗胶1h。[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。[13]取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2h。注意事项[1]严格遵守试验规则，物必准确。[2]由于好多药品是有毒的，对人体有害，请注意自身安全，做好防护。
33.要进行北方杂合反应前，必须先将RNA自洋菜胶体转移至硝化纤维纸（nitrocellulose membrane）或尼龙膜（nylon membrane）上，这一个过程称为转印（blotting）。一样常用的方法包括毛细管转移法（capillary transfer）、真空转移法（vacuum transfer）与电转印法（electroblotting）。毛细管转移法借助吸水纸吸取转移缓冲液时所产生的牵引力量将RNA自洋菜胶体转移至膜上；要转印完全，起码需要作用6 h以上。尽管所需花费的时刻比较长，以其不须要专门的仪器设备，毛细管转移法目前仍被普遍采纳。若分析RNA时采纳变性聚丙烯酰胺胶体电泳，则必须以电转印法进行RNA转印。至于膜的选择，硝基纤维素膜的优点是比较可不能产生非专一性反应；只是其一旦被润湿再烘干的后，容易碎裂，不适用于进行多次杂合反应。尼龙膜的优点是韧性好，与核酸结合的能力也相当强，正能够补偿硝基纤维素膜的缺点，现已成为主流。一旦将RNA转移至膜上后，即能够利用紫外线照耀法（uv irradiation）或真空干燥法（在真空下80℃加热2 h）将其固定于转印膜上。
34.观看结果 紫外灯下可见28S、18S和5S rRNA三条带，观看28S和18S二条带是否清晰，若28S的荧光强度为18S的二倍以上，则讲明RNA分子没有降解。溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA分子大许多，电泳迁移率低；而RNA中以rRNA最多，占到80%~85%，tRNA及核内小分子RNA占15%~20%，mRNA占1%~5%。故总RNA电泳后可出现特点性的三条带。28sRNA、18sRNA、5sRNA的确是rRNA，同时理论上讲28S条带的亮度应该为18S条带亮度的1～2倍，否则，当18S条带的亮度过高时讲明28SrRNA可能降解为18SrRNA了，意味着RNA可能严峻的讲解了。最后，这三条带代表的是总RNA的提取程度，不能讲明mRNA的提取量。28S比18S亮点比较好，5S亮的话就讲明RNA降解了 35.通过电泳看5s 18s 28s的情形，分解后5s变亮，18和28连成一片，呈弥散状。具体参考生物谷上面 那个RNA方面专门多内容的。使用一般的电泳也能够检测，然而要用DEPC水来处理电泳槽和配缓冲液，电泳前最好在65摄氏度变温一下。
1、裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。 2、酚一定要碱平稳。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损害，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。
3、各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。 4、取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。
5、异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
6、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等方法进行无核酸酶化处理。
7、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
RNA酶是RNA降解的要紧缘故，RNA酶是一类生物活性专门稳固的酶，除细胞内RNA酶外，环境中的灰尘、各种实验器皿和试剂、人类皮肤的汗液、唾液中均存在RNA酶，且RNA酶耐热、耐酸碱，煮沸也不能使之完全失活，蛋白变性剂可使之临时失活，但变性剂去除后，又可复原活性。因此在RNA提取过程中必须幸免外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶的活性。
1 去除外源性的RNA酶污染
实验过程必须戴手套操作，所有溶液和水均需加%的DEPC（焦碳酸二乙酯，是RNA酶的强抑制剂）室温搅拌过夜，然后高压处理，玻璃器皿洗净后在250摄氏度烘烤4小时。塑料器材最好使用灭菌的一次性用品等。
2 抑制内源性的RNA酶的活性
细胞破裂时，RNA酶开释出来，因此力争在RNA提取的初始时期，通过加入RNA酶抑制剂来抑制内源性的RNA酶的活性。36.烘干
分子生物学岗位职责2
分子生物学教案
第一章 绪 论
本单元或章节的教学目的与要求
主要介绍分子生物学定义、研究内容和发展简史及未来发展方向等。授课主要内容及学时分配 2 学时 第一章 绪 论
1.分子生物学定义：是研究核酸等生物大分子的形态、结构、功能、及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世
界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
分子生物学主要研究核酸在细胞生命过程中的作用，包括核酸本身的复制、保存以及基因的表达与调控规律，所以，这门学科其实应该
叫做核酸生物学（biology of nucleic acid）。
2.生物学大事年表 1859 年达尔文出版《物种起源》，提出了自然选择原则。但他无法解释生物
为什么能将性状遗传给下一代。
1865 年孟德尔通过他的豌豆发现了统一规律和分离规律。（Gregor Mendel,1822-1884）: 遗传学的奠基人
1869 年米歇尔(Friedrich Miescher)分离出核酸。
1879 年弗莱明(Walter Flemming)发现染色体，并描述了细胞分裂过程中染色体的行为。1900 年孟德尔的成果被重新发现。
1903 年萨顿(Walter Sutton)发现染色体是成对的，并携带遗传信息。
1905 年加洛德(Archibald Garrod)提出了人类先天代谢疾病的概念，这是人类自身遗传研究的开始。
1911 年摩尔根(Thomas Hunt Morgan)提出基因学说，阐释基因在染色体上的分布，以及繁殖过程中染色体重组形成独特新个体的过程。
1913 年斯特提万特(Alfred Henry Sturtevant)绘制出第一张线式基因图谱。1928 年格里菲斯(Frederick Griffith)发现了一种可以在细菌之间转移的遗传分子。1929 年列文(Phoebus Levene)提出 DNA 的化学成分和基本结构。
1944 年 Oswald Avery, Colin Macleod 和 Maclyn McCarty 指出，Griffith 发现的遗传分子就是 DNA。
1948 年鲍林(Linus Pauling)提出蛋白质为螺旋形的理论。
1950 年查加夫(Edwin Chargaff)发现核酸中四种碱基的含量比例是一定的。1951 年富兰克林(Rosalind Franklin)拍摄到了核酸的 X 射线衍射照片。
1952 年 Alfred Hershey 和 Martha Chase 利用病毒证实，传递遗传信息的是 DNA 而不是蛋白质。赫尔希也由于这一研究而荣获 1969 年的诺贝尔医学生理学奖。
1953 年沃森(James Watson)和克里克(Francis Crick)在《自然》杂志上发表 DNA 双螺旋结构的论文。，美国冷泉港研
究所科学家； ，英国剑桥大学教授。1953 年他们创立了 DNA 的双螺旋结构模型，获得 1958 年诺贝尔奖。
1956 年 Joe Hin Tjio 和 Albert Levan Hereditas 确定人类共有 23 对染色体。Arthur Kornberg 分离出 DNA 聚合酶。
1957 年 Francis Crick 发表《论蛋白质合成》的演讲，提出 DNA 制造蛋白质的概念。1959 年 Jerome Lejeune 发现唐氏综合症（先
天愚型）是由于人体的第 21 对染色体变异造成的。唐氏综合征是人类最早发现的因染色体缺陷造成的疾病。
1960 年 Sydney Brenner, Francis Crick，Francois Jacob 和 Jaque Monod 发现信使 RNA(mRNA)。
1961 年 Francois Jacob 和 Jacques Monod 提出在分子水平上特定基因被激活或抑制的机制。 ； ，法国科学家。由于他们提出了乳糖操纵子学说和在酶合成的遗传调控方面的重大贡献获得 1966 年诺贝尔奖。
1966 年 Marshall Nirenberg，Har Gobind Khorana 和 Robert Holley 阐明遗传密码。 ； ，美国科学家。由于他们各自发现了逆转录酶，打破了中心法则，该酶能使 mRNA 反转录成 cDNA，使真核基
因的克隆表达成为可能，为病毒学、遗传学、基因工程作出了重大贡献，他们获得 1965 年诺贝尔奖。
1967 年 Mary Wei 和 Howard Green 使用体细胞杂合技术推进人类基因图谱绘制。1969 年 Jonathan Beckwith 分离出一个细菌基因。
1970 年 Hamilton 发现了限制性内切酶，对核苷酸的排列顺序的研究及 DNA 重组技术的研究提供了帮助。
，美国霍普金斯大学医学院教授。由于他在限制性核酸内切酶方面的开创性成就获得 1978 年诺贝尔奖。
，瑞士巴塞尔生物研究中心教授。1968 年他第一个指出了限制性核酸内切酶的存在并分离了 I 型酶 EcoB，获得了 1978 年 获诺贝尔奖。
H Smith，美国霍普金斯大学教授。1970 年他首次分离纯化了Ⅱ型限制性核酸内切酶 Hind Ⅱ，并阐明了其切点的专一性，为基因工
程的诞生奠定了基础，获得 1978 年诺贝尔奖。1972 年 Paul Berg 创造出第一个重组 DNA 分子。
1973 年 Herbert Boyer 和 Stanley Cohen 发展了重组 DNA 技术，发现改造后的 DNA 分子可在外来细胞中复制。
，美国斯坦福大学分子生物学教授。他在质粒的研究中作出了开创性的研究，1973 年他又第一个实现了细菌间抗药性基因的转移，创立了基因工程重组模式。科学界把这一年定为基因工程诞生之年，以纪念这位基 因工程的创始人。
1974 年美国发表 Belmont 报告，确立科研中进行人体实验的政策。
1975 年 Mary-Claire King 和和 Allan 发现，人类和猩猩的基因相似度达到 99%。1975 年 Georges Kohler 和 Cesar Milstein 开发出生产单克隆抗体的技术。
1977 年 Walter Gilbert，Allan 和 Frederick Sanger 开发出 DNA 测序技术。，英国剑桥大学教授。由于他在蛋白质一级结构和核酸序列分析方面的天才创造和震惊世界的成果，在 1958 年和 1980 年先
后两次获得诺贝尔奖。他是生物医学科学领域里唯一两次获得这一最高荣誉的人，是一位谦虚谨慎、沉默寡言的伟大科学家。
1978 年 David Botstein 开创核酸限制性片段长度多态性分析技术，用于标志不同个体间的基因差别。
1978 年美国开始借助基因技术用大肠杆菌批量生产人类胰岛素。
，美国斯坦福大学化学教授。他首次用 SV40 作载体与λ噬菌体实现了两种病毒 DNA 的重组。由于他在重组 DNA 技术方面的功 绩获得 1980 年诺贝尔奖。
，美国加州大学生化教授，美国基因工程公司董事长。1977 年，他首次用细菌合成生长激素释放抑制素，是基因工程第一块
金牌的获得者。接着，1980 年，他又与华盛顿大学的学者合作，用酵母生产了人干扰素。他筹建了美国基因工程公司，是基因工程研 究中的权威科学家。
1982 年 GeneBank 数据库建立。
，美国哈佛大学教授。他与瑞士苏黎世大学和生物基因 公司 教授 Weimann 合作，用细菌生产了人干扰素。 也是测定 DNA 序列的化学直读法创始人。由于他对科学的巨大贡献，获 1980 年诺贝尔奖。1983 年 Kary Mullis 发展聚合酶链式反应（PCR）技术
1983 年辩认出与亨廷顿氏症有关的基因，这是科学家发现的第一个人类疾病基因。
1984 年 Alec Jeffreys 发明了基因指纹技术，可以用人的头发、血液和精液等来鉴定身份。1984 年关于人类基因组测序的第一次公开讨论开始。1986 年 Leroy Hood 开发自动测序机。1988 年人类基因组组织(HUGO)成立。
1990 年美国正式启动人类基因组计划。随后，德国、日本、英国、法国和中国也相继加入该计划。1991 年 Craig Venter 开发出新的测序技术。1994 年美国一公司推出新的转基因西红柿罐头，其保质期比普通西红柿更长，成为人类历史上第一个转基因食品。
1995 年 7 月，美国人类基因组研究所绘出了流感嗜血杆菌的基因图谱； 3 个月后，科学家又绘制出了生殖器支原体的基因图谱。1996 酵母基因组测序完成。
1997 年苏格兰罗斯林研究所培育出世界上第一例体细胞克隆动物绵羊“多莉”。1997 年大肠杆菌基因组测序完成。
1997 年参加人类基因组计划的科学家决定将研究成果无偿向全世界公开。1998 年结核性分枝杆菌以及梅毒螺旋体基因组测序完成。线虫基因组测序完成。
日本科学家用一头成年牛的体细胞克隆出 8 头克隆牛犊。
1999 年人类第 22 号染色体测序完成，这是第一个完成测序的人类染色体。2000 年果蝇和拟南芥的基因组测序完成。
Craig Venter 和 Celera 公司和人类基因组计划相继宣布，人类基因组草图完成。2001 年 Craig Venter 公布了绘制人类蛋白质组图谱的计划。2002 年水稻、小鼠、疟原虫和按蚊基因组测序完成2003 年人类基因组计划宣布，人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。 的发现
首先，40 年代发现了生物的遗传物质是 DNA。Avery 在美国 1934 年的一次学术会议上，首次报导了肺炎球菌(Djprococcus pneumonas)的转化。超越时代的科学成就往往不容易很快被人们接受，Avery 成就的命运也是一样，当时并没有引起阵阵掌声。事隔
10 年，他的论文才公开发表； Avery 的工作意义深远，他不仅证明 DNA 是遗传物质、还证明 DNA 可以把一个细菌的性状转给另一个
细菌，理论意义十分重大。正如诺贝尔奖金获得者 Lederberg 指出的，Avery 的工作是现代生物学科学性的革命开端、也可以说是基 因工程的先导。
早在 1928 年，Griffith 等人就发现，肺炎链球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。细菌的毒力（致病力）是由细胞表面夹膜中的多糖
所决定的。具有光滑外表的 S 型肺炎链球菌因为带有夹膜多糖而能使小鼠发病，具有粗糙外表的 R 型细菌因为没有夹膜多糖而失去致 病力。
Avery 用实验方法证实了 Griffith 的发现。Avery 第一个用实验方法证明了基因就是 DNA 分子。其次，50 年代搞清了生物遗传物
质的分子机制。1953 年，Watson 利 Crick 提出了 DNA 结构的双螺旋模型。这一成就对于生命科学的发展，作出了可与达尔文学说 媲美、与孟德尔定律齐名的贡献。
1952 年 Alfred Hershey 和 Martha Chase 利用病毒证实，传递遗传信息的是 DNA 而不是蛋白质。
美国冷泉港卡内基遗传学实验室的科学家 Hershey 和他的学生 Chase 在 1952 年从事噬菌体侵染细菌的实验。噬菌体专门寄生在细菌 体内。噬菌体感染细菌时，1）先是其尾部吸附在细菌表面；
2）随后像注射器那样由尾部将头部的 DNA 注入细菌体内，蛋白质外壳并不侵入； 3）进入菌的 DNA 借助宿主细菌的原料和能量，合成噬菌体自身的 DNA 和蛋白质； 4）新合成的 DNA 和蛋白质外壳，能组装成许许多多与亲代完全相同的子代噬菌体； 5）细菌细胞因噬菌体的大量增殖而破裂，结果释放出几十甚至几百个既有蛋白质外壳又有头部 DNA 的完整结构的噬菌体。
第三，60 年代确定了遗传信息的传递方式。从 1961 年开始，以 Nirenberg 等为代表的一批科学家，经过不倦的努力，确定遗传信息
是以密码方式传递的，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一种氨基酸。
到 1966 年全部破译了 64 个密码，编排了一个震惊世界的密码字典，阐述了中心法则，提出的遗传信息流是 DNA → RNA →蛋白质。
从此，千百年来使人迷惑不解的种瓜得瓜、种豆得豆的遗传现象，在分子水平上得到了合理解释。
4.分子生物学的研究内容： 1）DNA 重组技术 2）基因表达调控研究 3）生物大分子的结构功能研究
4）基因组、功能基因组与生物信息学研究
DNA 重组技术 DNA 重组技术（又称基因工程），它是将不同的 DNA 片段（某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起
来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格地说，DNA 重组技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他可能使生物细胞基因组结构得到改进的体系。
DNA 重组技术有着广阔的应用前景
1）可用于大量生产某些正常细胞代谢中产量很低的多肽，如激素、抗生素、酶类及抗体等，提高产量，降低成本，使许多有价值的多 肽类物质得到广泛应用。
2）可用于定向改造某些生物的基因结构，使它们所具备的特殊经济价值得到成百上千倍地提高。如用在分解石油、生产避孕疫苗及在 实验室生产蜘蛛丝等。
3）可用于基础研究。如对启动子的研究、增强子及对转录因子的克隆与分析的研究等。 基因表达调控研究
蛋白质分子参与被控制了细胞的一切代谢活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是 DNA）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。
在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境控制）
基因表达的调控主要发生在转录水平和翻译水平上。原核生物的基因组和染色体结构比真核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平上。
真核生物有细胞核结构，转录和翻译在时间和空间上是分开进行的，并且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控 可以发生在各种不同的水平上。
基因表达调控主要表现在信号转导研究、转录因子研究及 RNA 剪接 3 个方面。
信号传导是指外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部，并激活诸如离子通透性、细胞形状或其它细胞功能方面的应答过程。
当信号分子（配体）与相应的受体作用后，可以引发受体分子的构型变化，使之形成专一性的离子通道，也可以引发受体分子的蛋白激
酶或磷酸酯酶活性，还可以通过受体分子指导合成 cGMP、cAMP、肌醇三磷酸等第二信使分子。信号传导引起细胞功能的改变，主要是由于信号最后活化了某些蛋白质分子，使之发生构型变化，从而直接作用于靶位点，打开或关闭 某些基因。
转录因子是一群能与基因 5 '端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
在对植物的某些性状进行遗传分析时发现，某些基因的突变会影响其它基因的表达。例如，有 20 多个基因参与玉米花青素的生物合成，但其中的 Cl、r、pl、或 b 基因发生突变后，则这个代谢途径中的结构酶基 因全部被关闭。
真核基因在结构上的不连续性是近10 年来生物学上的重大发现之一。当基因转录成 pre-mRNA 后，在 5 '端加帽，3 '端加 poly（A），还要切去内含子，使外显子（编码区）相连后成为成熟 mRNA。
研究发现，许多基因中的内含子并不是一次全部切去，而是在不同的细胞或不同的发育阶段选择性剪切其中部分内含子，生成不同的 mRNA 及蛋白质分子。
RNA 选择性剪切是真核基因表达调控中一种比较灵活的方式。 生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学
一个生物大分子，包括核酸、蛋白质、多糖，具有生物活性的条件有两个： 1）具有特定的空间结构（三维结构）；
2）在它发挥生物学功能的过程中必定存在着结构和构象的变化。
结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。
它包括结构的测定、结构运动变化规律的探索及结构与功能间的相互关系 3 个主要研究方向。 基因组、功能基因组与生物信息学
2001 年 2 月，Nature 和 Science 同时发表了人类基因组全序列，是人类历史上最伟大的成就之一。
现已有数十种原核生物、酵母、果蝇、拟南芥等真核生物的基因组基本被破译了，为人类认识自然、改造自然打下了坚实的基础。
测定基因组序列是了解基因的第一步，只有知道了基因所编码的蛋白质的功能和活性，才能指导人们利用这些基因产物。
于是，又提出了“蛋白组”计划（又称“后基因组计划”或“功能基因组计划”）, 目的是快速、高效、大规模鉴定基因的产物和功
能。基因组信息量庞大，如人细胞中携带 29 亿多个碱基对。
依靠计算机快速高效运算并进行统计分类和结构功能预测的生物信息学相应诞生了。有了生物信息学知识，人们可以最大限度地开发和运用基因组学所产生的庞大数据。5.分子生物学展望
1）绵羊多利是核转移克隆技术的第一次大的成功。在这一技术中，一个细胞的 DNA 被转移到失去自身遗传物质的空的卵细胞中。然
后，卵细胞在转移 DNA 的控制下进行发育。成为克隆技术发展的一个里程碑。
2）Kind 的研究组在牛和猪的细胞中成功地使用了基因打靶技术的技术，并称他们计划培育“敲除”猪----这种猪将携带的一种
蛋白质来帮助人体免疫系统接受移植的猪器官。3）人类基因组计划与生物制药产业发展前景。
———人类基因组计划（HGP）是人类科学史上的伟大工程，人类基因组序列的“工作框架图”的绘就，是该计划实施进程中的一个重
要里程碑；———HGP 从整体上解决肿瘤等疾病的分子遗传学问题，6 千多种单基因遗传病和多种多基因疾病的致病基因和相关基因的定位、克隆和功能鉴定是 HGP 的核心部分，它将彻底改变传统新药开发的模式，并赋予基因技术的商业价值；
———HGP 将进一步深化生物制药的产业结构，引发基因诊断、基因疫苗、基因治疗、基因芯片等新兴产业；
———HGP 完成后，人类基因序列将全部输入公共基因数据库，使我国的制药工业在一个新的起点上与国外制药企业展开竞争，从我国自主克隆的人类基因和公共数据库的人类基因中开发出具有自主知识产权的基因组药物，成为我国生物制药摆脱困境的有效途径；
———国内上市公司已进军基因技术的相关产业，但尚处于初级阶段，HGP 是国内生物制药公司进行企业模式调整的重要契机，未来生
物制药公司的竞争力主要取决于推出自主知识产权新药的速度、数量和质量。
4）人类基因组学的前途有关基因组的大量知识将扩大我们对生物学过程的认识，并带来可评价患病危险性的新诊断手段，创立个人化
医疗学。基因组信息的利用会增进对生物学过程的了解而变革生命科学，使科学家可以针对着影响健康和疾病的具体过程。
获得利益的商业领域有药物发现和开发、医学诊断、农业，等等。
影响新药开发的一个最重要的因素是可以用于开发新药的已知目标分子数量有限。疾病目标分子可以受一种药物影响并在人体内引起后
续的所希望的生物学反应。历史上，发现新目标分子的过程极慢，极费钱，因为它依赖于做出发现的试验和纠正方法。基因组学研究将
使药物设计人员直接针对有利害关系的分子，所以减少上述依赖。这样不仅是生产出新的更好的药物，而且缩短新药上市周期，并降低 成本。
由于药物的严重副作用，美国每年有 220 万人入院，因这些副作用而死亡者超过 10 万人。已有具体器官对药物的基因表达分布图，研
究人员可以更精确地研究新药化合物的毒性。此外，基因表达数据与代谢途径多态性信息结合起来，将为个别患者对不同剂量的反应方
式提供重要指标，因而明显减少治疗中产生的意外副作用。
受人类基因组数据影响的另一领域是制药基因组学。这个学科的重点是找出患者内可能影响药疗功效即个人对一具体药物的吸收与代谢的遗传变异，发展更加个人化的药物疗法。因为越来越多的证据说明，某一药物并非对所有的人有同样的作用，所以制药基因组学对于
制药和生物技术界来说已变得非常重要，以致几乎所有制药公司都在成立制药基因组学机构。以基因组学为基础的新治疗学将集中确定
某个人患某一种病的危险性，而留意该患者的具体基因以及与疾病相关的任何变化。这些新诊断手段可能对一患者患一具体病症的潜在危险性做出更准确评价，给予更好的预防性治疗。
农业是可能得益于基因组学研究的另一领域。对动植物疾病进行诊断并针对那些疾病发展处治方法的能力，应能使农产品品质改善，产
量提高。例如，来自疾病的遗传信息的比较或抗虫害植物品系和不抗虫品质的对比以及选育计划中有利试验的运用，将使可在世界各个
不同农业区种植的新品系数量和成功率明显增加。这样不仅会增加食物数量，也提高其营养质量。5）基因疗法的典型例子是半乳糖血症病人的基因治疗。这种病人由于细胞内缺少基因 G，不能产生半乳糖-1-磷酸干扰素基因，每 106 个细胞能生产干扰素 5x106 单位，并且 95 ％分泌至细胞外。
1985 年，美国加州大学 Maeda 用杆状病毒作载体，家蚕作表达系统，合成α干扰素基因在家蚕细胞及家蚕中的高表达”研究。他们用 PCR 技术从人染色体中扩增出了 566bp α 1-干扰素基因，用
家蚕核型多角体病毒(BmNPV)转移载体 pBF5 介导，在多角体基因强启动子驱动下，分别在家蚕细胞和虫体中实现了高效表达。采用微
载体 Cytodex3 高密度培养家蚕细胞(10L 规模)，α 1-干扰素效价达到 单位／ m1 ；当用重组病毒注射感染 5 龄家蚕
时(3 万条虫规模)，表达效价平均达到 1x107 单位／条蚕。
α模板-dNMP 高能复合物。DNA 聚
合酶具有对此复合物核对的能力，看掺入的核苷酸是否正确。这个核苷酸（dNMP）这时可能被释放的机会远远高于正确核苷酸。这 就是动力学校对模型。
4）DNA 聚合酶具有聚合酶活性，还具有 5 ' → 3 ' 和 3 ' → 5 ' 的外切酶活性。DNA 聚合酶的 3 ' → 5 ' 外切酶活性可以
随时将已经掺入的错配的脱氧核糖核苷酸从生长的多核苷酸链上去除，保证了 DNA 复制的忠实性和准确性。
的半保留复制机理
DNA 的复制是分别以亲代 DNA 链为模板合成两条子代 DNA 链；在子代 DNA 双链中，一条是新合成的，一条是亲代的，称为 DNA 的半保留复制。
复制的起点、方向和速度
复制时，双链 DNA 要解开两股链分别进行，所以这个复制起点呈现叉子的形式 , 称为复制叉。复制子（replicon）定义： DNA 分子上一个独立的复制单位。一个复制子只含有一个复制起点（origin,ori）。
通常，细菌、病毒和线粒体的 DNA 分子都是作为单个复制子完成复制的，而真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复制。
复制叉以 DNA 分子上某一特定顺序为起点，向两个方向等速生长前进。一个复制原点连接到任一 DNA 分子上都支持其复制的能力。复
制原点一般由 A-T 丰富区组成。在真核细胞中，DNA 的复制属于细胞周期的一部分。细菌中，DNA 复制与细胞生长相协调。首先是
复制周期的起始频率被调整到与细胞生长的速率相适应，其次是复制周期的完成与细胞分裂相联系。 复制的几种主要方式 线性 DNA 双链的复制线性 DNA 先
在 ori 处形成复制眼，从复制眼开始可以单向或双向复制，真核生物都是多复制眼起始的双向复制。 环状 DNA 双链的复制 1）θ型复制
环形 DNA 大多采用θ型复制，如 。
特点：从原点 ori 开始，通常采用双向等速复制，不断扩大复制泡，形成θ环。2）滚环型复制（rollingcircle）
某些环形的病毒 DNA，如θ x174、λ噬菌体都是以这种方式复制。这是一种单向复制类型。
3）D 环复制双链环在固定点解开进行复制。但两条链的合成是高度不对称的，一条链上迅速合成出互补链，另一条链则成为游离的 单链环（D-环）。
原核生物和真核生物 DNA 的复制特点 原核生物 DNA 的复制特点 双螺旋的解旋
DNA 复制时，双链首先解开，形成复制叉
复制叉的形成过程有多种酶和蛋白质参与。将主要的酶和蛋白质介绍如下。1）单链结合蛋白（SSB 蛋白）SSB 蛋白可牢固地结合在单链 DNA 上，在原核生物中表现出协同效应，如第一个 SSB 蛋白结合到
DNA 上去的能力为 1，第二个 SSB 蛋白结合能力则高达 103。SSB 蛋白的作用是保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单
链结构，它以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下，重新循环。所以，SSB 蛋白只保持单链的存在，并不起解链的作用。
SSB 没有催化功能，它可以特异性地结合在单链区，使之免被核酸酶水解，起到保护和维持单链的作用。2）DNA 解链酶（DNAhelicase）
用于把 DNA 双链解开形成单链。具有 ATPase 活性，利用水解 ATP 释放的能量，催化双链 DNA 解链。大部分 DNA 解链酶（包括大肠
杆菌解链酶 II、III、T4 噬菌体 dda 基因、T4 基因 41 和人解链酶等）可沿滞后链模板的 5 '→ 3 '方向并随着复制叉的前进
而移动，只有另一种解链（Rep 蛋白）是沿前导链模板的 3 '→ 5 '方向移动。因此推测 Rep 蛋白和特定 DNA 解链酶分别在 DNA 的两条母链上协同作用，以解开双链 DNA。
DNA 的解链过程，首先是在拓扑异构酶 I 的作用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。
参与解链的除一组解链酶外，还有 DNA 蛋白等。
一旦局部解开双链，就必须有 SSB 蛋白来稳定解开的单链，以保证局部结构不会恢复成双链。接着，由引发酶组成的引发体迅速作用
于两条单链 DNA 上。不论是前导链还是滞后链，都需要一段 RNA 引物以开始子链 DNA 的合成 冈崎片段与半不连续复制在DNA 的复制过程中，前导链是连续复制的，而滞后链是通过冈崎片段的连接来合成的，是不连续的，称之为 DNA 的半不连续复制。所有
DNA 聚合酶的方向都是 5 '→ 3 '，而不是 3 '→ 5 '。为了解释 3 '→ 5 '是如何合成滞后链的，冈崎提出了 DNA 的半不连续复制。
现在已知，一般原核生物的冈崎片段要长些，真核生物中的要短些。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界是有普遍性的，因而称之为 DNA 的半不连续复制。 复制的引发和终止
复制起始时发生的事件：①双链 DNA 在一个很小的区域内打开，这是 oriC 区域特有的；②由解旋酶催化，开始解螺旋，并持续进行
下去；③形成引物，第一个核苷酸装配到引物上；这些事件对前导链只发生一次，而后滞链上每次开始合成冈崎片段时都要发生。
目前已知的 DNA 聚合酶都只能延长已存在的 DNA 链，而不能从头合成 DNA 链。
研究发现，DNA 复制时，往往先由 RNA 聚合酶在 DNA 模板上合成一段 RNA 引物，再由 DNA 聚合酶从 RNA 引物 3 '端开始合成新的DNA 链。对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有一段 RNA 引物，DNA 聚合酶就能以此为起点一直合成下去。但对于滞后链
来说，引发过程就十分复杂，需要多种蛋白质和酶的协同作用，还牵涉到冈崎片段的形成和连接。滞后链的引发过程：
引发体：后滞链的引发过程往往由引发体（primosome）来完成。先是由 6 种蛋白： n,n ' ,n '' ,dnaB,C 和 I 构成引发前体，而
后与引发酶（primase）结合进一步组装成引发体。
引发体像火车头一样在滞后链分叉的方向上前进，并在模板上断断续续地引发生成滞后链的引物 RNA 短链，再由 DNA 聚合酶 III 作
用合成 DNA，直到遇到下一个引物或冈崎片段为止。由 RNaseH 降解 RNA 引物，并由 DNA 聚合酶 I 将缺口补齐，再由 DNA 连接酶
将两个冈崎片段连在一起形成大分子 DNA。总结
前导链的连续合成和后滞链的不连续合成a.旋转酶（topoII）改变双螺旋的构象，解螺旋酶解开双链。 结合到解开的单链上。c.引发体合成 RNA 引物。 聚合酶Ⅲ作用下合成先导链。e.滞后链开始合成，形成第一个冈崎片段。f.复制叉继续前进，前导链连续合成，滞后链上合成新的 RNA 引物。g.第二个冈崎片段形成，DNA 聚合酶Ⅰ切去引物，并加上脱氧核苷三磷酸。h.间隙被 DNA 连接酶封闭。链的终止
除 Tus 蛋白以外，链的终止看起来不需要太多的蛋白质参与。当复制叉前移，遇到 20bp 重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus 复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在 DNA 拓扑异构酶 IV 的作用下使复制叉解体，释放子链（图 2-23）。 聚合酶
现已发现在大肠杆菌中存在 DNA 聚合酶 I、II、III。
1)DNA 聚合酶Ⅰ主要负责 DNA 损伤的修复和冈崎片段之间间隙的填补。用枯草杆菌蛋白酶处理 DNA 聚合酶Ⅰ可得两个片段，大片段
分子量 76kd，被叫作 klenow 片段，广泛用于 DNA 序列分析中。
① 5' → 3' 聚合活性要求有双链 DNA 模板和具有 3' 羟基的引物，活性很高，可达 1000 核苷酸 /min。② 3' → 5' 外切活性可
以对不配对的局部单链进行识别，切除不配对碱基，又称“校正功能”。③ 5' → 3' 外切活性主要功能是切除复制过程中的引物。
Pol Ⅰ的 5' → 3' 外切活性有三个特点： a.必须有 5'-P 末端。b.被切除的核苷酸必须是氢键配对的。c.可以切除脱氧核糖
核苷酸，也可以切除核糖核苷酸。此酶被认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起着重要作用。它也可用以除去冈崎片段 5 '端 RNA 引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将此片段连接起来。DNA 聚合酶 II 是一条 120kD 的肽链，催化 5 '→ 3 '方
向合成 DNA，也具有 3 '→ 5 '外切酶活性但没有 5 '→ 3 '外切酶活性。可能在当细胞 DNA 受到化学或物理损伤时，DNA 聚合酶 II 在修复过程中起特殊作用。DNA 聚合酶Ⅲ pol Ⅲ是体内 DNA 复制的主要承担者，是复制的主要酶类。全酶由多亚基
组成，至少有 10 种，共 22 个亚基：α 2 ε 2 θ 2 δ 2 γ 2 η 2 δ '2 χ 2 θ 2 β 2 其中α、ε、θ三种亚基组成核心酶，其它为辅助蛋白。
RRNA 的功能与蛋白质生物合成相关，可分别与 mRNA、tRNA 作用，催化肽键的形成。引物酶和 RNA 聚合酶引物酶：用于合成引物 的酶。利福平：抑制 RNA 的转录，使细菌无法繁殖。用利福平处理发现：先导链不能合成，而后随链能合成。
解螺旋酶用于把 DNA 双链解开形成单链。具有 ATPase 活性，利用水解 ATP 释放的能量，催化双链 DNA 解链。
真核生物 DNA 的复制特点
真核生物 DNA 的复制与原核生物 DNA 的复制有很多不同。真核生物每条染色体上可以有多处复制起点，而原核生物只有一个起始点。
真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起点上 DNA 的复制不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起点上可以连续开始
新的 DNA 复制，表现为虽只有一个复制单元，但可有多个复制叉。真核生物 DNA 的复制子称为 ARS（autonomouslyreplicatingsequences），长约 150bp 左右，包括数个复制起始必需的保守区。真核生物 DNA 复制的起始需
要起始原点识别复合物（ORC）参与。真核生物 DNA 复制叉的移动速度大约只有 50bp/s，还不到大肠杆菌的 1/20，因此，人类
DNA 中每隔 3000 ～ bp 就有一个复制起始位点。真核生物 DNA 复制必需的成份 1.染色体 DNA 复制必需三种核苷酸序列①复制起点②着丝粒③端粒。 引物(RNAPrimer)，一般 8 ～ 14nt，带游离 3'-OH 末端。
3.参加 DNA 复制的主要酶和蛋白质。① DNA 聚合酶(DNAPolymerase)真核 DNA 复制的主要酶 DNAPola/ δ。功能 : 从 5' → 3'
方向延伸与模板互补的子代链。②引发酶(Primase)与其他多种蛋白组成多蛋白复合体-引发体(Primosome)，催化 RNA 引物合成和复制起始。③ DNA 连接酶(DNALigase)，催化一个双链 DNA 的 5 ' 磷酸与另一双链 DNA 的 3 '-OH 形成磷酸二酯键。④ DNA
解链酶(DNAHelicase), 打开 DNA 双链。⑤增殖细胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)，辅助催化前导链合成。
⑥端粒酶(Telomerase)末端复制问题。端粒酶负责染色体末端(端粒)复制 , 是由 RNA 和蛋白质组成的核糖核蛋白。其中的 RNA 成分是端粒复制的模板(因此端粒是逆转录酶)。作用 : 维持端粒长度。端粒酶活性可用基于 PCR 的“ TRAP ”（Telomeraserepeatamplificationprotocol）法测定（Kim,Netal.,science,266,2011-2014(1994)端粒与细胞寿命。端粒、端
粒酶与肿瘤的关系：绝大多数恶性肿瘤具有端粒酶活性但端粒缩短，但也有约 5% 的肿瘤无端粒酶活性且端粒较长。
端粒酶作为新的肿瘤标志和肿瘤治疗靶点。
真核生物中发现有 5 种 DNA 聚合酶，分别是：α、β、γ、δ、ε。
⑴ DNA 聚合酶α是 DNA 复制的主要酶类，由 4 个亚基组成。原因是：①所有强烈抑制α酶的抑制剂都能抑制细胞的复制。②α酶的温度敏感突变株使该细胞的 DNA 复制成呈温度敏感型。③显微注射α酶的抗体可以抑制 DNA 的复制。④α酶的活性随细胞周期而变化，S 期活性最高。⑵ DNA 聚合酶δ具有 3 '→ 5 '外切酶活性，对于复制的真实性十分重要。同是也是前导链合成的主要酶类。聚合 酶γ负责线粒体基因组的复制。
目前认为：α酶和δ酶都是真核 DNA 复制酶。δ酶在复制中合成前导链，α酶合成后滞链。δ和ε都具有 3 ‘→ 5 '外切核酸酶的活性，说明二者都有校对功能。δ和ε之间的差别是：在催化持续的 DNA 合成时，δ需要一个辅助蛋白因子－－增值细胞核抗原
（proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）, 而ε则不需要。β可能主要在 DNA 损伤的修复中起作用。ε的主要功能可能是在 去掉 RNA 引物后把缺口补全。 DNA 复制的调控
原核细胞的生长和增殖速度取决于培养条件，但在生长、增殖速度不同的细胞中，DNA 链延伸的速度几乎是恒定的，只是复制叉的数 量不同。
迅速分裂的细胞具有较多复制叉，而分离缓慢的细胞复制叉较少并出现复制的间隙。细胞内复制叉的多少决定了复制起始频率的高低，这可能是原核细胞复制的调控机制。复制起始频率的直接调控因子是蛋白质和 RNA。 大肠杆菌染色体 DNA 的复制调控 原核生物 DNA 链的延伸速度是恒定的。与生长、增殖相配合协调的 DNA 的合成，主要依靠复制叉数量的不同。迅速分裂的细胞具有
较多的复制叉，分裂缓慢的细胞复制较细胞复制叉的多少取决于复制起始的频率，这是原核细胞复制的调控点。复制子的调控由复制
起始因子和起始位点两部分组成。 的起始位点主要是 oriC，与蛋白相互作用来启动复制。主要的起始因子有 dnaA、dnaH 等蛋白质，它们通过与始位点形成复合物相互作用，确定复制的起始频率。研究发现： dnaA 对复制起正调控作用。
.2ColE1 质粒 DNA 的复制
ColE1DNA 复制不依赖于其本身编码的蛋白质，而完全依靠宿主 DNA 聚合酶。质粒 DNA 编码两个负调控因子 Rop 蛋白和反义 RNA（RNA1），它们控制了起始 DNA 复制所必须的引物合成.细胞内 RNA1 的浓度决定了 ColE1 质粒的复制起始频率。Rop 蛋白能
提高 RNA1 与引物前体的相互作用，从而加强了 RNA1 的负调控作用。（图 2-24）
.3 真核细胞 DNA 复制的调控真核细胞中 DNA 复制有三个调控点：①细胞生活周期水平的调控 也称为限制点调控，即决定细胞停留在 G1 还是进入 S 期。许多外部因素和细胞因子参与限制点调控。促细胞分裂剂、致癌剂、外科
切除、细胞质因子等可诱发 G1 进入 S 期。②染色体水平的调控
决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在 S 期起始复制，这种有序复制的机理还不清楚。
③复制子水平的调控。
决定复制的起始与否。这种调控从单细胞生物到高等生物是高度保守的。
此外，真核生物复制的起始还包括转录活化、复制起始复合物的合成和引物合成等阶段，许多参与复制起始蛋白的功能与原核生物中类
似。 的修复 DNA 修复(DNArepairing)是细胞对 DNA 受损伤后的一种反应，这种反应可能使 DNA 结构恢复原样，重新能执 行它原来的功能。 回复修复
这是较简单的修复方式，一般都能将 DNA 修复到原样。
1.光修复 这是最早发现的 DNA 修复方式。修复是由细菌中的 DNA 光复活酶来完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相
邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受 300 － 600nm 波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体
分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从 DNA 链上释放，DNA 恢复正常结构。后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中，人体细胞 中也有发现。
2.单链断裂的重接 DNA 单链断裂是常见的损伤，其中一部分可仅由 DNA 连接酶(ligase)参与而完全修复。此酶在各类生物各种
细胞中都普遍存在，修复反应容易进行。但双链断裂几乎不能修复。
3.碱基的直接插入 DNA 链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被 DNA 嘌呤插入酶(insertase)识别结合，在 K ＋存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键，且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，使 DNA 完全恢复。
切除修复(excisionrepair)是修复 DNA 损伤最为普遍的方式，对多种 DNA 损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚
体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的 DNA 修复机制。修
复过程需要多种酶的一系列作用，基本步骤包括：
①首先由核酸内切酶识别 DNA 的损伤位点，在损伤部位的 5 ′侧切开磷酸二酯键。不同的 DNA 损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识
别和切割。②由 DNA 解链酶将有损伤的 DNA 片段解离。③在 DNA 聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按 5 ′→ 3 ′方向合成 DNA 链，填补已切除的空隙。④由 DNA 连接酶将新合成的 DNA 片段与原来的 DNA 断链连接起来。这样完成的修复能使 DNA 恢复
原来的结构。 重组修复(recombinationalrepair)主要用于 DNA 复制时的损伤修复。DNA 重组修复方式： ①受损伤的 DNA 链复制时，产生的子代 DNA 在损伤的对应部位出现缺口。
②另一条母链 DNA 与有缺口的子链 DNA 进行重组交换，将母链 DNA 上相应的片段填补子链缺口处，而母链 DNA 出现缺口。
③以另一条子链 DNA 为模板，经 DNA 聚合酶催化合成一新 DNA 片段填补母链 DNA 的缺口，最后由 DNA 连接酶连接，完成修补。重
组修复不能完全去除损伤，损伤的 DNA 段落仍然保留在亲代 DNA 链上，只是重组修复后合成的 DNA 分子是不带有损伤的，但经多次
复制后，损伤就被“冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤 DNA 的。 SOS 修复
SOS 修复是指 DNA 受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种 DNA 修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细
胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复(error pronerepair)，使细胞有较高的突变率。当 DNA 两条链的损
伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的 DNA 链空缺，再由损伤诱导产生的一
整套的特殊 DNA 聚合酶-SOS 修复酶类，催化空缺部位 DNA 的合成，这时补上去的核苷酸几乎是随机的，但仍然保持了 DNA 双链的完整性，使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高的突变率。应该说目前对真核细胞的 DNA 修复的反应类型、参与修复的酶类和修
复机制了解还不多，但 DNA 损伤修复与突变、寿命、衰老、肿瘤发生、辐射效应、某些毒物的作用都有密切的关系。人类遗传性疾病
已发现 4000 多种，其中不少与 DNA 修复缺陷有关，这些 DNA 修复缺陷的细胞表现出对辐射和致癌剂的敏感性增加。DNA 修复小结
环境和生物体内的因素都经常会使 DNA 的结构发生改变。DNA 的复制会发生碱基的配对错误；体内 DNA 会有自发性结构变化，包括
DNA 链上的碱基异构互变、脱氨基、碱基修饰、DNA 链上的碱基脱落等。外界射线的照射等物理因素，烷化剂、碱基类似物、修饰
剂等化学因素都能损伤 DNA 的结构，变化包括有相邻嘧啶共价二聚体的形成、碱基、脱氧核糖和磷酸基团的烷基化和其它修饰、碱 基脱落、DNA 单链断裂、双链断裂、DNA 链内交联、链间交联、DNA 与周围的蛋白质交连等。最后能导致 DNA 的点突变、DNA 核苷酸的缺失、插入或转位、DNA 链的断裂等，结果可能影响生物细胞的功能和遗传特性，这些改
变可能会导致细胞死亡、也有机会使细胞获得新的功能或进化，也可能细胞只有 DNA 结构的遗传性改变而没有表型变化，视 DNA 结
构变化的部位、类型和范围不同而异。
生物在进化过程中获得的 DNA 修复功能，对生物的生存和维持遗传的稳定性是至关重要的。对有些 DNA 的损伤，细胞能将其完全修
复到原样，如可将嘧啶二聚体切开、DNA 单链断裂可重新连接、碱基缺失可再配对插入、加成的烷基可以移除、一条链上的碱基或核
苷酸的错误可以切除并依赖互补链作模板而复制重新修复等。对 DNA 较严重的损伤，细胞可采取重组修复、SOS 修复等方式进行反
应，以期提高细胞的存活率，但不能完全消除 DNA 的损伤，会带给细胞较高的突变率。DNA 的损伤和修复与遗传、突变、寿命、衰
老、辐射效应、肿瘤发生、某些毒剂的作用、以及某些遗传性疾病等有密切的关系。目前对 DNA 损伤修复的认识还不透彻。 DNA 的转座
DNA 的转座，或称移位（transposition），是由可移位因子（transposableelement）介导的遗传物质重排现象。与 DNA 的同源
重组相比，转座作用发生的频率虽然要低得多，但它仍然有着十分重要的生物学意义
1.转座子（transposon,Tn）是存在于染色体 DNA 上可自主复制和位移的基本单位。插入序列（insertionsequence，IS）它
们是不含宿主基因的最简单的转座子，它们是细菌染色体或质粒 DNA 的正常组成部分。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基 因的突变。
插入序列对插入点后的基因产生极性效应。IS 序列都是可以独立存在的单元 , 带有介导自身移动的蛋白。IS 除带有编码转座酶的 基因外，不带任何其它遗传信息。IS 的结构特点：①长度在 1000bp 左右。②末端具有倒置重复序列，转座时常复制靶位点附近的一小段 DNA（4 ～ 15bp），形
成位于 IS 两端的正向重复区。③具有编码转座酶的基因。
2 复合式转座子（compositetransposon）是由两个重复序列夹着一个或多个结构基因组成的转座单位，往往存在于 R 因子及其它
质粒中。有的复合转座子的重复序列就是 IS。
IS 序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合式转座子。
除了末端带有 IS 序列的复合式转座子以外，还存在一些没有 IS 序列、体积庞大的转座子——TnA 家族，一般长 4500~bp。3 转座机制
转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，即受体分子中有一段很短的（3 ～ 12bp）、被称为靶序列的 DNA 会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。转座可分为复制性和非复制性两大类：
1）在复制性转座中，整个转座子被复制了，所移动和转位的仅仅是原转座子的拷贝。转座酶（transposase）和解离酶
（resolvase）分别作用于原始转座子和复制转座子。TnA 类转座主要是这种形式。2）在非复制性转座中，原始转座子作为
一个可移动的实体直接被转位，IS 序列、Mu 及 Tn5 等都以这种方式进行转座。 转座作用的遗传学效应 1）转座引起插入突变
如果插入位于某操纵子的前半部分，就可能造成极性突变，导致该操纵子后半部分结构基因表达失活。2）转座产生新的基因 3）转座产生染色体畸变 4）转座引起生物的进化
重点、难点及对学生的要求（掌握、熟悉、了解、自学）掌握 DNA 的组成及结构结构，了解核小体的装配，了解原核生物基因组的特点和真核生物基因组的结构特点。掌握 DNA 分子复
制的一般特点。掌握真核生物 DNA 复制必需的成份。掌握 DNA 复制的调控。了解 DNA 的修复，掌握 DNA 的转座的机理。
辅助教学情况（多媒体课件、板书、绘图、标本、示教等）复习思考题 1.核酸的组成 2.何为 C 值矛盾
3.真核细胞 DNA 序列大致上可分为哪 4 类
4.为什么说细胞对 DNA 损伤的修复能力对细胞的生存是至关重要的 ? 5.体内那些因素会导致 DNA 结构的变化 ? 细胞能采取那些办法保持 DNA 结构的稳定性 ? 6.那些环境因素容易损伤生物体内的 DNA? 损伤有那些方式和类型 ? 结果对生物细胞会有些什么影响 ? 7.现在所知生物细胞对 DNA 损伤修复有那些方式 ? 修复反应的结果会如何 ?8..真核生物基因组的结构特点
9.原核生物基因组的特点 10.描述 DNA 的二级结构
分子复制的一般特点是什么 的半保留复制机理 13.真核生物 DNA 的复制特点
14.为什么说细胞对 DNA 损伤的修复能力对细胞的生存是至关重要的 ? 15.体内那些因素会导致 DNA 结构的变化 ? 细胞能采取那些办法保持 DNA 结构的稳定性 ? 16.那些环境因素容易损伤生物体内的 DNA? 损伤有那些方式和类型 ? 结果对生物细胞会有些什么影响 ? 17.现在所知生物细胞对 DNA 损伤修复有那些方式 ? 修复反应的结果会如何 ? 第三章 生物信息的传递（上）－转录
本单元或章节的教学目的与要求：掌握转录的基本过程、机制 授课主要内容及学时分配 8 学时
DNA 序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成信使 RNA、翻译成蛋白质的过程来控制生命现象。基因表达
包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。转录是指以 DNA 的一条链为模板在 RNA 聚合酶催化下，按照碱基
配对原则，合成一条与 DNA 链的一定区段互补的 RNA 链的过程称为转录。翻译是指以新生的 mRNA 为模板，把核苷酸三联遗传密码子
翻译成氨基酸序列、合成多肽的过程，是基因表达的最终目的。
编码链（有义链）：我们把与 mRNA 序列相同的那条 DNA 链称为编码链（coding strand）。反义链（无意义链，负链）：在 RNA 的转录中，用作模板的 DNA 链称为反义链（antisense 的转录 转录的基本过程
无论是原核细胞还是真核细胞，转录的基本过程都包括：模板的识别、起始、延伸和终止。
启动子：与 RNA 聚合酶特异性结合以起始转录的一段 DNA 序列。终止子：引起转录终止的一段 DNA 序列。增强子：调节启动子，增强转录效率的一段 DNA 序列。
1）模板识别阶段主要指 RNA 聚合酶与启动子 DNA 双链相互作用并与之相结合的过程。
转录起始前，启动子附近的 DNA 双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板 DNA 的配对。转录起始就是 RNA 链上第一个核苷酸 键的产生。
2）转录起始后直到形成 9 个核苷酸短链，是通过启动子阶段，此时 RNA 聚合酶一直处于启动子区，新生的 RNA 链与 DNA 链的结合不够牢固，很容易从 DNA 链上掉下来并导致转录重新开始。一旦 RNA 酶成功地合成 9 个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入正
常的延伸阶段。所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。一般来说，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。3）延伸阶段：当 RNA 聚合酶离开启动子，沿 DNA 链移动并使新生 RNA 链不断伸长的过程就是延伸阶段。大肠杆菌 RNA 聚合酶的活性一般是每秒钟合成 50 ～ 60 个核苷酸
4）终止：当终止反应 包括识别特定的终止位点，碱基不再加到链上，转录复合物停止移动，酶和 RNA 从模板上释放。当 RNA 链延
伸到转录终止位点时，RNA 聚合酶不再形成磷酸二酯键，RNA-DNA 杂合物分离，转录泡瓦解，DNA 恢复成双链状态，而 RNA 聚合酶和 RNA 链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。真核细胞中模板的识别与原核细胞不同。
真核生物 RNA 聚合酶不能直接识别基因的启动子区，所以，需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白质按特定顺序结合于启动子上，RNA 聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物（preinitiation transcription complex，PIC）以保证有效地起始转录。
转录和翻译的速度基本相等，37 ℃ 时，转录生成 mRNA 的速度大约是每分钟 2 500 个核苷酸，即每秒钟合成 14 个密码子，而蛋
白质的合成速度大约是每秒钟 15 个氨基酸。
正常情况下，从一个基因开始表达到细胞中出现其 mRNA 的间隔约为 分钟，而再过 分钟就能在细胞内检测到相应的蛋白质。 转录机器的主要成分 RNA 聚合酶
RNA 聚合酶主要以双链 DNA 为模板（若以单链 DNA 为模板，则活性大大降低），以四种核苷三磷酸为活化前体，并以 Mg2+/Mn2+ 为
辅助因子，催化 RNA 的起始、延伸和终止，它不需要任何引物。RNA 聚合酶是转录过程中的关键酶。
原核和真核生物的 RNA 聚合酶虽然都能催化 RNA 的合成，但在分子组成、种类和生化特性上不同。1.原核生物的 RNA 聚合酶
聚合酶的组成及各亚基的功能 和其它原核细胞一样，只有一种 RNA 聚合酶。大肠杆菌的 RNA 聚合酶全酶由 5 种亚基α 2 ββ' w ζ组成，ζ因子与其它
部分的结合不是十分紧密，它易于与β'βα 2 分离，含有α 2 ββ' w 的酶称为核心酶，加上ζ亚基则成为全酶。五种亚基的功能
分别为：α亚基：可能与核心酶的组装及启动子识别有关，并参与 RNA 聚合酶和部分调节因子的相互作用。β亚基：含催化部位，起
催化作用，催化形成磷酸二酯键。w 亚基：在全酶中存在，功能不清楚。β'亚基：与 DNA 模板结合功能。ζ亚基：识别起始位点。
它负责模板链的选择和转录的起始。
不同的原核生物，具有基本相同的核心酶，但其ζ亚基有所差别，决定了原核基因的选择性表达。2.真核生物的 RNA 聚合酶真核生物中已发现有三种细胞核的 RNA 聚合酶，分别称为 RNA 聚合酶 I、II、III，分子量大致都 在 50 万道尔顿左右。
它们专一性地转录不同的基因，因此由它们催化的转录产物也各不相同。RNA 聚 I 合成 RNA 的活性最显著，它位于核仁中，负责转
录编码 rRNA 的基因。而细胞内绝大部分 RNA 是 rRNA。
RNA 聚合酶 II，位于核质中，负责核内不均一 RNA 的合成，而 hnRNA 是 mRNA 的前体。RNA 聚合酶 III 负责合成 tRNA 和许多小的核内 snRNA。
鹅膏蕈碱是真核生物 RNA 聚合酶特异性抑制剂，三种真核生物 RNA 聚合酶对鹅膏蕈碱的反应不同。不同生物 3 类聚合酶的亚基种类和大小各异，但共性是： 1）聚合酶中含有两个相对分子质量超过 1 × 105 的大亚基 ；
2）同种生物 3 类聚合酶有“共享”小亚基的倾向，即有几个小亚基是其中 3 类或 2 类聚合酶所共有的。 转录复合物
转录可被分成 4 个阶段： 启动子的选择（起始位点的识别）转录起始 链的延伸 转录终止 启动子的选择包括 RNA 聚合酶全酶对启动子的识别，聚合酶与启动子可逆性结合形成封闭复合物（closed complex）。此时，DNA 仍处于双链状态。
伴随着 DNA 构象上的重大变化，封闭复合物转变成开放复合物（open complex），聚合酶全酶所结合的 DNA 序列中有一小段双链 被解开。
对于强启动子来说，从封闭复合物到开放复合物的转变是不可逆的，是快反应。开放复合物与最初的两个 NTP 相结合并在这两个核苷
酸之间形成磷酸二酯键后，即转变成包括 RNA 聚合酶、DNA 和新生 RNA 的三元复合物。除了 RNA 聚合酶之外，真核生物转录过程中至少还需要 7 种辅助因子参与。因为不少辅助因子本身就包含多个亚基，所以转录起始复合物的分子量特别大。见表 3-4 真核生物 RNA 聚合酶 II 所形成的转录起始复合物（p69）。一般情况下，该复合物可以进入两条不同的反应途径：
* 一是合成并释放 2 ～ 9 个核苷酸的短 RNA 转录物，即所谓的流产式起始；
* 二是尽快释放ζ亚基，转录起始复合物通过上游启动子区并产生由核心酶、DNA 和新生 RNA 所组成的转录延伸复合物。
ζ因子的作用只是起始而已，一旦转录开始，它就脱离了起始复合物，而由核心酶负责 RNA 链的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是启动子的选择和转录的起始，而核心酶的作用是链的延伸。
转录延伸复合物是转录循环中十分重要的环节。与转录起始复合物相比，延伸复合物极为稳定，可长时间地与 DNA 模板相结合而不解
离。只有当它遇到转录终止信号时，RNA 聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNA-DNA 杂合物解离，释放转录产物并导致聚合酶本身从 模板 DNA 上掉下来。
TF Ⅱ D 介导形成转录前起始复合物(pre intitiationcomplex, PIC)RNA 聚合酶Ⅱ转录前起始复合体的形成示意图转录前先是 TF Ⅱ－ D 与 TATA 盒结合① TF Ⅱ－ A 结合在 TF Ⅱ－ D 上游② TF Ⅱ－ B 结合在转录起始位点附近③ RNA 聚合酶Ⅱ与 TF Ⅱ－ F 偶联形成复合体结合到转录起始位点④ TF Ⅱ－ E 结合在 RNA 聚合酶Ⅱ的下游⑤ TF Ⅱ－ H 和 TF Ⅱ－ J 结合上去，形成完整的转录起始复合物和 TF Ⅱ－ J 结合上去，形成完整的转录起 启动子与转录起始
大肠杆菌 RNA 聚合酶与启动子的相互作用主要包括启动子区的识别、酶与启动子的结合及ζ因子的结合与解离。
启动子区的基本结构
启动子：是一段位于结构基因 5 '端上游区的 DNA 序列，在转录起始之前被 RNA 聚合酶结合的 DNA 部位称为启动子。
转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是 RNA 聚合酶与启动子的相互作用。启动子的结构影响了它与 RNA 聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。
转录单元（transcription unit）是一段从启动子开始到终止子（terminator）结束的 DNA 序列，RNA 聚合酶从转录起点开始
沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条 RNA 链。在细菌中，一个转录单元可以是一个基因，也可以是几个基因。
转录起点是指与新生 RNA 链第一个核苷酸相对应 DNA 链上的碱基，研究证实通常为一个嘌呤。常把起点前面，即 5 '末端的序列称为上游（upstream）;而把其后面即 3 '末端的序列称为下游（downstream）。
在描述碱基的位置时，起点为＋ 1，下游方向依次为＋ 2，＋ 3 ??，上游方向依次为－ 1，－ 2，－ 3 ??。
Pribnow 框（-10 序列）在转录开始位点上游-10 区域，大致在-4~-13 之间有一个典型的 6bp 序列，大多为 TATAAT 或稍有变化的形式，称为 Pribnow 框或-10 序列（TATA 区）。该共同序列的频度为： T 89A 89T 50A 65A 65T100 目前认为，Pribnow 框决
定着转录的方向，是 RNA 聚合酶牢固结合的位置。
-35 序列（Sexfama box）在转录开始位点上游-35 区域也有一段保守序列，共同序列是 TTGACA，称为-35 区。其保守频度为： T85T 83G 81A 61C 69A 52 下降突变：启动子里核苷酸的改变造成启动子效率降低。突变后的-10 区和-35 区越接近共同序列，转
录的 RNA 就越多；越远离共同序列，转录的 RNA 就越少。
在真核生物中，Hogne 等先在珠蛋白基因中发现了类似 Pribnow 区的 Hogne 区（Hogne box），这是位于转录起始位点上
游－ 25 ～－ 30bp 处的共同序列 TATAAA，也称为 TATA 区。
另外，在起始位点上游－ 70 ～－ 78bp 处还有另一段共同序列 CCAAT，这是与原核生物－ 35bp 区相对应的序列，称为 CAAT 区（CAAT box）。 启动子区的识别
一般认为，RNA 聚合酶并不直接识别碱基对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。
在启动子区 DNA 双螺旋结构中，腺嘌呤分子上的 N6、鸟嘌呤分子上的 N2、胞嘧啶分子上的 N4 都是氢键供体，而腺嘌呤分子上的 N7、N3，胸腺嘧啶分子上的 O4、O2，鸟嘌呤分子上的 N7、O6、N3 和胞嘧啶分子上的 O2 都是氢键受体。
由于它们分别处于 DNA 双螺旋的大沟和小沟内，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有处于特定空间构象的氢键受体与供体，当它
们与启动子中对应的分子在一定距离内互补时，就形成氢键，相互结合。这种氢键互补学说较为圆满地解释了启动子功能既受 DNA 序
列的影响，又受其构象影响这一事实。 酶与启动子区的结合在 RNA 聚合酶与启动子相互作用过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链 DNA 相结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二
元开链复合物（图 3-8，p74）。
解链区一般在－ 9 ～＋ 13 之间，而酶与启动子结合的主要区域在其上游。一旦开链区解链，酶分子能以正确的取向与解链后的有关 单链相互作用，形成复合物。
因此，RNA 聚合酶既是双链 DNA 结合蛋白，又是单链 DNA 结合蛋白。DNA 开链是按照 DNA 模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。 － 10 区和－ 35 区的最佳距离
在原核生物中，－ 35 区和－ 10 区的距离大约是 16 ～ 19bp，小于 15bp 或大于 20bp 都会降低启动子的活性。
保持启动子这两段序列以及它们之间的距离是十分重要的，否则就会改变它所控制的基因表达水平。在细菌中常见两种启动子突变：
下降突变（down mutation）：如果把 Pribnow 其从 TATAAT 变成 AATAAT，就会大大降低其结构基因的转录水平；
上升突变（up mutation）: 即增加 Pribnow 区共同序列的同一性。
突变后的-10 区和-35 区越接近共同序列，转录的 RNA 就越多；越远离共同序列，转录的 RNA 就越少。例如，在乳糖操纵子的启动子中，将其 Pribnow 区从 TATGTT 变成 TATATT，就会提高启动子的效率，提高乳糖操纵子基因的转录水平。 增强子及其功能
增强子（enhancer）：能强化转录起始的序列称为增强子或强化子
在 SV40 的转录单元上存在增强子，它位于转录起始位点上游约 200bp 处，为两段 72bp 的重复序列，它们不是启动子的一部分，但
能增强或促进转录的起始，除去这两段序列会大大降低这些基因的转录水平，若保留其中一段或将其取出插在 DNA 分子的任何部位，就能保持基因的正常转录。
除 SV40 外，还在反转录病毒基因、免疫球蛋白基因、胰岛素基因、胰麋蛋白酶基因等许多基因的启动子区中陆续发现了增强子的存在增强子很可能通过影响染色质 DNA-蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构，从而使得 RNA 聚合酶更容易与模板 DNA 相结合，起始基因转录。
增强子的作用有以下特点： ①增强效应 非常明显②增强子提高同一条 DNA 链上基因转录效率，可以远距离作用，通常可距离
1 ～ 4kb、个别情况下离开所调控的基因 30kb 仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。③增强子作用与其序列的正反 方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。④增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现活性。⑤但增强
子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录。⑥增强子必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强
转录的作用。⑦增强子一般具有组织或细胞特异性。⑧大多为重复序列。沉默子 最早在酵母中发现，以后在 T 淋巴细胞的T 抗原受体基因的转录和重排中证实这种负调控顺式元件的存在。目前对这种在基因转录降低或关闭中起作用的序列研究还不多，但
从已有的例子看到：沉默子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。
真核生物启动子对转录的影响
启动子是指确保转录精确而有效地起始的 DNA 序列。
它是在 DNA 序列 5 '上游区有一段与原核生物 Pribnow 区相似的富含 TA 的保守序列。由于该序列前 4 个碱基为 TATA 区，所以又 称为 TATA 区（TATA box）。
真核基因的启动子在－ 25 ～－ 35 区含有 TATA 序列，在－ 70 ～－ 80 区含有 CCAAT 序列（CAAT box），在－ 80 ～－ 110 含有 GCCACACCC 或 GGGCGGGG 序列（GC box）。
习惯上，将 TATA 区上游的保守序列称为上游启动子元件(upstream promoter element，UPE)或称上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）。
原核和真核基因转录起始位点上游区的结构有很大差别（图 3-9，p76）：
1）原核基因启动区范围很小，一般情况下，TATAAT（Pribnow 区）的中心位于－ 7 ～－ 10，上游－ 30 ～－ 70 区为正调控
因子结合序列，＋ 1 ～－ 20 区为负调控因子结合序列；
真核基因的调控区较大，TATAA/TA 区位于－ 20 ～－ 30，而上游－ 40 ～－ 110 区为上游激活区。2）除 Pribnow 区之外，原核基因启动子上游只有 TTGACA 区（－ 30 ～－ 40）作为 RNA 聚合酶的主要结合位点，参与转录调控； 而真核基因除了含有可与之相对应的 CAAT 区之外，大多数基因还拥有 GC 区和增强子区。TATA 区和其它两个 UPE 区的作用有所不同： TATA 区：使转录精确地起始
UPE 区：对启动子的生物活性有很大影响
CAAT 区和 GC 区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。
CAAT 区对转录起始频率的影响最大，该区任一碱基的改变都将极大地影响靶基因的转录强度。TATA 区和相邻的 UPE 区之间插入核苷酸也会使转录减弱。
GC 区、CAAT 区和 TATA 区都有重要功能，但不不是每个基因的启动子区都包含这三种序列。（表 3-5，p77）
基因转录实际上是 RNA 聚合酶、转录调控因子和启动子区各种调控元件相互作用的结果。 原核生物和真核生物 mRNA 的特征比较
信使核糖核酸（meenger RNA，mRNA）在大肠杆菌细胞中占总 RNA 的 2 ％左右（tRNA 占 16 ％，rRNA80 ％以上）。
许多基因的 mRNA 在体内还是相当稳定的，半衰期从几个小时到几天不等。原核和真核细胞内 mRNA 的生物合成过程和成熟的 mRNA 的结构不同：
真核细胞 mRNA 的最大特点是它往往以一个较大相对分子质量的前体 RNA 出现在核内，只有成熟的、相对分子质量明显变小并经过化
学修饰的 mRNA 才能进入细胞质，参与蛋白质的合成。所以，真核细胞 mRNA 的合成和功能表达发生在不同的空间和时间范畴内。
原核生物中，mRNA 的转录和翻译不仅发生在同一个细胞空间里，而且这两个过程几乎是同步进行的，蛋白质合成往往在 mRNA 刚 开始转录时就被引发了。
一个原核细胞的 mRNA（包括病毒）有时可以编码几个多肽，而一个真核细胞的 mRNA 最多只能编码一个多肽。
原核生物常以 AUG（有时 GUG，甚至 UUG）作为起始密码子，而真核生物几乎永远以 AUG 作为起始密码子。 原核生物 mRNA 的特征
1）原核生物 mRNA 的半衰期短：转录开始 1min 后，降解就开始了，即当一个 mRNA 的 5 ' 端开始降解时，其 3 ' 端可能仍在合 成或被翻译。
MRNA 降解的速度大概只有转录或翻译速度的一半。
因为基因转录和多肽链延伸的速度基本相同，所以细胞内某一基因产物（蛋白质）的多少决定于转录和翻译的起始效率。
2）许多原核生物 mRNA 以多顺反子的形式存在： 细菌 mRNA 可以同时编码不同的蛋白质。
单顺反子（monocistronic mRNA）: 只编码一个蛋白质的 mRNA。多顺反子（polycistronic mRNA）：编码多个蛋白质的 mRNA。
操纵子（operon）：多顺反子 mRNA 是一组相邻或相互重叠基因的转录产物，这样的一组基因称为一个操纵子，它是生物体内的重 要遗传单位。
几乎所有 mRNA 都可以被分成 3 部分：编码区、位于 AUG 之前的 5 '端上游非编码区以及位于终止密码子之后不翻译的 3 '端下游 非编码区。
对于第一个顺反子来说，一旦 mRNA 的 5 '端被合成，翻译起始位点即可与核糖体相结合，而后面几个顺反子翻译的起始就会受到 其上游顺反子结构的调控。
一种情况是，第一个蛋白质合成终止以后，核糖体分解成大、小亚基，脱离 mRNA 模板，第二个蛋白的翻译必须等到新的小亚基和大
亚基与该蛋白起始密码子相结合后才可能开始（图 3-12a,p80）。
另一种情况是，当前一个多肽翻译完成后，核糖体分解成大、小亚基，小亚基也可能不离开 mRNA 模板，而是迅速与游离的大亚基结
合，启动第二个多肽的合成（图 3-12b,p80）。
3）原核生物 mRNA 的 5 ' 端无帽子结构，3 ' 端没有或只有较短的 poly（A）结构。原核生物起始密码子 AUG 上游 7 ～ 12 个核苷酸处有一个 SD 序列（Shine-DNAlgarno sequence）的保守区，因为该序列与
16SrRNA3 '端反相互补，所以被认为在核糖体-mRNA 的结合过程中起作用。
所有已知大肠杆菌 mRNA 的翻译起始区都含有 4 ～ 5 个（至少 3 个）对应于 SD 序列的核苷酸。表 3-6 SD 序列的例子（p80）。
细菌 16SrRNA 的 3 '末端既非常保守，又高度自我互补，能形成“发卡”结构（图 3-14，p82）。 真核生物 mRNA 的特征
“基因”的分子生物学定义：产生一条多肽链或功能 RNA 所必须的全部核苷酸序列。真核生物 mRNA 结构上的最大特征是 5 '端的帽子及 3 '端的 poly（A）结构。
1）真核生物 mRNA 的 5 ' 端的帽子结构，真核生物 mRNA 的 5 ' 端大多具有 m7GPPPN 的帽子结构。5 ' 终端是在一个 mRNA 转
录后加上去甲基化的鸟嘌呤（G）。
MRNA 5 ' 端加“ G ”的反应是由腺苷酸转移酶完成的，这个反应非常迅速。
据测算，在新生的 mRNA 链达到 50 个核苷酸之前，甚至可能在 RNA 聚合酶 II 离开转录起始位点之前，帽子结构就已加到 mRNA 的第一个核苷酸上了。这就是说，mRNA 几乎一出生就戴上了帽子。
一般认为，帽子结构是 GTP 和原 mRNA5 '三磷酸腺苷（或鸟苷）缩合反应的产物，新加上的 G 与 mRNA 链上所有其它核苷酸方向
正好相反，像一顶帽子倒扣在 mRNA 链上，故而得名。
帽子结构可能使 mRNA 免遭核酸酶的破坏，而且，有帽子结构的 mRNA 更容易被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质的合成。mRNA 的帽子结构常常被甲基化，由尿苷酸-7-甲基转移酶来催化。帽子结构的功能： ? 对翻译起识别作用。②可以保护 mRNA 免遭核酸酶降解。不是所有的真核生物 mRNA 都有 5 '端帽子结构。2）绝大多数真核生
物 mRNA 具有 poly（A）尾巴。除组蛋白基因外，真核生物 mRNA 的 3 '末端都有 poly（A）序列，长度为 40 ～ 200bp。几 乎所有真核基因的 3 '末端转录终止位点上游 15 ～ 30bp 处的保守序列 AAUAAA 对于初级转录产物的准确切割及加 poly（A）是
必须的。poly（A）是 mRNA 由细胞核进入细胞质所必须的形式，它大大提高了 mRNA 在细胞质中的稳定性。当 mRNA 刚从细胞核
进入细胞质时，其 poly（A）尾巴一般较长，随着 mRNA 在细胞质内逗留时间的延长，poly（A）逐渐变短消失，mRNA 进入
降解过程。真核生物 mRNA 大都有 poly（A）尾巴这一特性，广泛用于分子克隆。反转录反应。尽管大部分真核 mRNA 大都有
Poly（A）尾巴，细胞中仍有多达 1/3 没有 poly（A）尾巴的 mRNA。真核 mRNA 中 poly(A)化必要的 2 个序列信号和切断位点：
Human α-globin UUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAGCCUGUGUGUGCCUGGGUUCUCU human β-globin CCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCAAUGAUGUAUUUAAAUUAU human growth hormoneCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAUUGUCUGACUAGGUGUCCUC 真核基因大多是断裂的，也就是说，一个基因可由多个内含子和外显子间隔排列而成。研究表明，内含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超过 99 ％。
由 DNA 转录产生的原始转录产物－－核不均一 RNA（hnRNA,heterogeneous nuclear RNA），即 mRNA 的前体，经过 5 '加帽
和 3 '酶切加 poly（A）尾，再经 RNA 的剪接，编码蛋白质的外显子部分就连接成为一个连续的可读框（open reading frame, ORF），通过核孔进入细胞质，就能作为蛋白质合成的模板了。 终止和抗终止
一般情况下，RNA 聚合酶起始基因转录后，它就会沿着模板 5 '→ 3 '方向不停地移动，合成 RNA 链，直到碰上终止信号时才与模
板 DNA 相脱离并释放新生 RNA 链。
终止发生时，所有参与形成 RNA-DNA 杂合体的氢键都必须被破坏，模板 DNA 链才能与有义链重新组合成 DNA 双链。
不依赖于ρ因子的终止
模板 DNA 上存在终止转录的特殊信号－－终止子，每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子。
分子生物学岗位职责3
生物信息部
生物信息工程师
职位职责：
1.生物信息数据分析与数据挖掘； 2.产品生物信息技术支持。
应聘要求：
1.生物信息学、医学、生物及生物技术相关专业本科或以上学历； 2.具有良好的英文阅读和中文写作能力；
3.了解或熟悉Linux操作系统及Linux Shell脚本，了解MYSQL数据库，有Perl、Python、R或者PHP编程经验优先；
4.了解常用生物信息学工具(BLAST，ClustalW 等)和公共基因信息数据库资源(Genbank等)，有生物学数据处理经验者优先；
5.有责任心，头脑灵活，良好的沟通协调能力及团队合作精神；
生物信息高级工程师
职位职责：
1.生物信息数据分析与数据挖掘；
2.高通量检测数据统计分析；
3.生物信息数据的采集、整理、挖掘和利用；
4.根据客户分析要求，进行检测数据分析，出具分析报告,并负责对所分析数据进行问题解答。
应聘要求：
1.生物信息学专业硕士或以上学历；医学、统计学、数学专业的等有生物信息数据分析经验者亦可；
2.具有良好的中英文阅读写作能力，能流利阅读、翻译英文科技文献；
3.对生物统计学原理及意义有深刻的理解及应用能力；
4.有责任心，头脑灵活，良好的沟通协调能力及团队合作精神；
5.熟悉Linux操作系统及Linux Shell脚本，熟悉MYSQL数据库；
6.掌握Perl或R，有一定的编程能力；
7.熟悉常用生物信息学工具(BLAST，ClustalW 等)和公共基因信息数据库资源。
信息技术部
网站美工
职位职责：
1.负责公司所属网站界面的规划和设计；
2.配合程序开发人员进行相应页面制作、图片处理和FLASH动画制作；
3.电子杂志的美术设计和排版。
应聘要求：
1.大专以上学历，计算机或美术设计相关专业；
2.熟练Flash、PhotoShop、DreamWeaver、CorelDRAW等相关工具的使用；
3.精通CSS和HTML，熟练运用DIV+CSS制作网页；
4.能够了解FireFox、IE、Chrome 及Safari 等不同浏览器间的兼容问题；
5.熟悉InDesign或者iBooks Author优先考虑。市场部
市场主管
职位职责：
1.执行公司市场战略规划，制定公司的市场总体工作计划，实施市场推广、品牌、公关、活动等方面的工作；
2.组织和监督实施年度市场推广计划的落实；
3.掌握市场动态，及进行应对准备策略；
4.建立完善工作流程以及制度规范；对团队成员和相关部门进行市场培训和指导；
5.领导交办的其他事项。
应聘要求：
1.扎实的分子生物学知识，能够快速理解公司产品；硕士优先；
2.良好的Marketing触觉和推广意识；
3.有一定的网络知识和熟练的计算机日常操作能力。
市场专员
职位职责：
1.根据产品推广要求，制定常规活动、促销推广方案并组织实施参与重大促销推广活动的策划和执行；
2.收集、分析市场信息、动态，协助制定和完成新产品推广计划，完成各类围绕品牌、提升品牌和发展品牌的推广活动。
应聘要求：
1.本科以上，分子生物学专业，女生优先；
2.较强的市场策划能力和信息分析能力,要对产品的运作、销售渠道、公关及促销有全面的了解；
3.具备良好的语言表达能力和沟通能力，对工作认真负责，有媒体沟通经验；
4.有一定的网络推广知识，具备一定互联网基础。
研发部
产品生产专员
职位职责：
1.产品质量检测；
2.产品分装、包装；
3.产品说明书、标签和包装盒的整理和保存等；
4.配合其他部门工作。
应聘要求：
1.大专以上学历，良好的英文水平；
2.热爱实验室工作者，活泼开朗、思维活跃者；
3.有高度责任心和敬业精神，工作认真细致，条理性强；
4.良好的沟通协作能力和团队合作精神，独立思考和解决问题的能力。
细胞生物学研究员
职位职责：
1.细胞水平Aay开发、优化和项目的执行；
2.进行细胞培养、原代细胞分离、慢病毒等相关产品研发
3.撰写工作和实验结果的报告，撰写产品手册。 应聘要求：
1.生物，生化，细胞生物、分子生物及相关专业；硕士或以上学历；英语六级，计算机水平优秀； 具有3－5年以上科研经历（博士学历可为应届生）；
2.精通细胞生物学理论和实验技术，有一定的开拓创新能力，具有独立解决问题的能力，具有从实验设计到实验结果分析的能力；
3.能流利阅读并编译生物领域相关资料；
4.熟悉生物学领域发展新动态和新技术，敢于接受挑战性的工作，能承受一定的工作压力；
5.具有慢病毒包装、干细胞、原代细胞分离培养等工作经验优先；
6.诚实正直，工作认真严谨，具有良好的团队合作精神，具有高度的责任感和敬业精神。
研发高级研究员
职位职责：
1.领导一个小组进行产品的设计、开发、优化和项目的执行；
2.完成技术报告、计划总结、Protocol的撰写；
3.对相关人员进培训。
应聘要求：
1.毕业于生物技术领域较为知名的高校和研究院所，拥有生物化学、生物技术，分子生物或其他相关专业硕士或以上学历，具有3－5年以上科研经历（博士学历可为应届生）；
2.具有良好的生物化学和酶学基础和技能；
3.有项目开发工作经验及管理工作经验，较强的计划、组织协调能力；
4.知识面广，思路开阔，较强的分析问题、解决问题和交流的能力；
5.计划性强，有撰写项目建议书、项目阶段报告及结题报告的经验和能力。
蛋白质表达与纯化研究员
职位职责：
1.从事基因工程重组蛋白的表达，细胞破碎，蛋白质提取和纯化以及SDS-PAGE、酶活鉴定等技术工作；
2.完成上级主管安排的实验工作、研究方向；
3.撰写实验报告等。
应聘要求：
1.生物化学、生物技术或其它相关专业本科以上，有蛋白纯化及分析相关工作经验者优先；
2.熟练掌握重组蛋白的浓缩，超滤，AKTA纯化系统，各种蛋白纯化介质的使用方法，蛋白电泳，酶活检测。
3.具有扎实的专业基础知识，善于学习和沟通，责任心强；
具有很强的动手能力，热爱实验室工作。
核酸部
配料员
职位职责：
负责常规使用试剂的配制。应聘要求：
学历不限，年龄不限，有一定化学试剂配制的基础最佳。
分子生物学研究员
职位职责：
研究和优化克隆流程，解决困难问题，构建新载体。应聘要求： 1.生物及生物技术相关专业硕士或以上学历，且有3年以上相关工作研究经验；
2.具有良好的英文阅读和中文写作能力；
3.有扎实的生物化学和分子生物学基础，擅长进行PCR和载体构建；熟练运用NCBI等相关数据库、PCR设计及基因序列分析相关软件的使用；
4.诚实正直，工作认真严谨，富有探索、钻研精神和具有良好的团队合作精神，具有高度的责任感和敬业精神。
分子生物学实验员
职位职责：
主要协助技术员进行科研工作（要有独立操作实验的能力）。
应聘要求：
1.对生物技术行业感兴趣，有强烈的探索欲望；
2.中专，大专或同等学历，本科及以上学历勿投；
3.工作认真，责任心强，有自律精神，有团队合作精神。
4.有相关分子生物学实验经验者优先；
5.生物学相关专业（即有微生物、生物化学或分析化学的基础）优先。
分子生物学技术员
职位职责：
负责基因的克隆和载体的构建。
应聘要求：
1.有相关研究经验的本科生或硕士优先；
2.生物学相关专业毕业，有PCR和载体构建工作经验者优先考虑；
3.有扎实的生物化学和分子生物学基础；有较强的分子生物学技术操作技能，以及独立思考解决问题能力； 4.熟悉NCBI等相关数据库、PCR设计及基因序列分析相关软件的使用；
5.熟练操作各种相关仪器；熟练查阅相关中英文资料；
6.具有较强的英语读写能力、协调能力和团队合作精神。
实习助理
职位职责：协助实验员或技术员开展实验工作。应聘要求：
1.对生物技术行业感兴趣，有强烈的探索欲望；
2.中专，大专或同等学历；
3.工作认真，责任心强，有自律精神，有团队合作精神。
4.生物学相关专业（即有微生物、生物化学或分析化学的基础）优先。
蛋白部
实验员
职位职责：
协助技术员日常工作，完成工作任务（要有独立操作实验的能力）。应聘要求：
1.对生物技术行业感兴趣，有强烈的探索欲望；
2.中专，大专或同等学历，具有相关发酵或微生物培养实验经历者优先； 3.工作认真，责任心强，有自律精神，有团队合作精神。
4.熟练操作各种相关仪器；熟练查阅相关中英文资料；
5.具有较强的学习能力和动手操作能力、协调能力和团队合作精神；
蛋白表达技术员
职位职责：
协助技术员日常工作，完成工作任务。
应聘要求：
1.本科学历，生化相关专业毕业，具有相关发酵或微生物培养实验经历者优先；
2.具有一定生物学理论基础，具有英语基础，会使用计算机。
3.熟悉NCBI等相关数据库，了解PCR设计及基因序列分析相关软件的使用；
4.熟练操作各种相关仪器；熟练查阅相关中英文资料；
5.具有较强的学习能力和动手操作能力、协调能力和团队合作精神；
蛋白纯化技术员
职位职责：
完成重组蛋白的表达、纯化及检测工作。
应聘要求：
1.本科学历，生物学相关专业毕业，有蛋白及免疫实验经验者优先考虑；
2.有扎实的生物化学和分子生物学基础；有较强的蛋白技术操作技能，以及独立思考解决问题能力；
3.熟悉NCBI等相关数据库，了解PCR设计及基因序列分析相关软件的使用；
4.熟练操作各种相关仪器；熟练查阅相关中英文资料；
5.具有较强的英语读写能力、协调能力和团队合作精神。
分子生物学岗位职责4
SectionA 1 三个域：真细菌，古细菌，真核生物 2 组装中的主要作用力：非共价健作用力
SectionB 1 蛋白质纯化的分析方法
正电荷：天冬氨酸 谷氨酸
负电荷：赖氨酸 精氨酸
组氨酸
极性：天冬酰胺 谷氨酰胺
苏氨酸 丝氨酸 半胱氨酸
非极性：脂肪族 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸
异亮氨酸 甲硫氨酸 脯氨酸
芳香族 苯丙氨酸
酪氨酸 色氨酸 Cys 二硫键 Gly 无手性 Pro 亚氨基酸
芳香族氨基酸最大吸收峰280mm 3 蛋白质的一级(决定蛋白折叠及其最后的形状的最重要的因素)：氨基酸脱水缩合形成肽链 N端到C端
共价键
二级：多肽链中空间结构邻近的肽链骨架通过氢键形成的特殊结构。
α转角
β螺旋 氢键为主要作用力
三级： 多肽链中的所有二级结构和其他松散肽链区域（散环结构）通过各种分子间作用力（非共价键为主），弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。
非共价键
四级： 许多蛋白分子由多条多肽链（亚基，subunits）构成。组成蛋白的各亚基以各种非共价键作用力为主，结合形成的立体空间结构即为四级结构。非共价键
4 偶极：电子云在极性共价键的两原子间不均匀分布，使共价键两端的原子分别呈现不同的电性
兼性离子：具有正电荷（碱性），又具有负电荷（酸性）的分子 双极性分子：
Section C 1核酸的光学特性：
增色性：一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力增加的现象 减色性：一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力减少的现象 Reason: 碱基环暴露在环境中的越多，对紫外的吸收力越强 Absorbance（吸收值）：Nucleotide > DNA/RNA > dsDNA 核酸的最大吸收峰260mm(碱基有芳香环)芳香族氨基酸最大吸收峰280mm A260/A280:
纯的 dsDNA： 纯的 RNA： 纯的 Protein： 2 Tm 值（熔解温度）：热变性时，使得DNA双链解开一半所需要的温度。
Tm=2x(A+T)+ 4x(G+C)
Tm值与DNA分子的长度，及GC的含量成正比
Annealing（退火）:热变性的DNA经过缓慢冷却后复性
快速冷却： Stay as DNA
缓慢冷却: 复性成dsDNA 3 脱氧核糖核酸与核糖核苷酸得到画法
4 支持双螺旋结构的两个实验：查戈夫规则
X射线晶体衍射 5 双螺旋的内容：
双链之间的关系：DNA分子由两条链组成双链反向平行(5’?3’ 方向)
两链的碱基通过氢键互补配对，A:T;G:C。
双链序列反向互补
各基团排列方式：糖-磷酸骨架DNA分子排列在外;
碱基对平面相互平行，排列在DNA分子的内部。空间结构为：右手双螺旋结构
每转一圈~10个碱基对，每一圈长度
双链螺旋中形成大沟，小沟。
6 碱对DNA的影响：高pH值对DNA的影响比低pH值的要小。
高 pH 值(pH>11)会改变碱基构象，使DNA变性（双链解旋，成单链）
RNA的影响：高pH值，2’羟基会攻击磷酸二酯键，使其断裂，形成2’，3’-环式磷酸二酯键，从而使RNA分子断裂
7 共价闭合环状DNA(convalently closed circular DNA, cccDNA）。即通过共价键结合形成的封闭环状DNA分子。
8 超螺旋DNA（Supercoil DNA）:松弛型双链DNA进一步旋转后，再形成闭环结构时，就会形成DNA超螺旋结构
L=T+W 判断是否为超螺旋 正负超螺旋
9 拓扑异构酶：暂时断裂DNA分子中一条或两条单链上的磷酸二酯键，改变DNA分子的连接数及拓扑状态。
功能：消除DNA复制和转录等过程产生的超螺旋。
细胞中，Ⅰ型酶与Ⅱ型酶的活性保持一种平衡状态。Ⅱ型酶的“使DNA超螺旋化” 与Ⅰ型酶“使DNA松驰化” 相抗衡，从而使DNA保持适当的超螺旋密度。
10 EB: 嵌入DNA配对碱基之间，使DNA分子在嵌入处局部解旋，增加ccDNA其它部位的正超螺旋
11 Type II RE
二型限制性内切酶:识别位点一般为４～8个碱基对的回文序列
如：EcoRI
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5
Section D 1 染色体的折叠：串珠结构 ：核心组蛋白:H2A, H2B, H3 and H4.连接组蛋白 H1
核小体
30nm纤丝
高级环状结构（染色质的最高结构）
紧密缠绕结构
2 着丝粒：两侧是大量的名叫卫星DNA的重复序列
端粒：上百个短的重复序列
作用：端粒DNA 形成特殊的环状二级结构，保护染色体末端不被核酸外切酶降解。
抵消DNA复制时每一轮复制都导致两末端形成的后随链比母链要短一截的现象对染色体的影响
3 异染色质：高度浓缩，无转录活性
常染色质：结构松散，有转录活性
DNaseI 敏感区域：对区域内DNA的转录活跃
串珠结构
DNaseI 超敏感区域：转录活跃的基因的调控区域
DNA裸露 4 原核染色体结构：非特异性DNA结合蛋白：类组蛋白
位点特异性DNA结合蛋白：与特殊的DNA序列结合有其他特殊的生理功能：RNA polymerases
对结构域的形成也很重要
56 复性动力曲线：
Low C0t: 高重复 卫星DNA Moderate C0t : 中重复 串联基因簇
反转座子 High C0t :单拷贝或低重复
大肠杆菌基因组
7 染色体结构对基因转录的影响
CpG 抑制→CpG位点中的胞嘧啶的C-5常发生甲基化(CpG甲基化），CpG 甲基化可能可以DNA转录被限制→哺乳动物基因组中，有些区域含有很多未甲基化的CpG 位点，被称为CpG 孤岛。
甲基化—转录抑制
去甲基化—恢复转录
组蛋白的乙酰化：核心组蛋白N-端的Lys被乙酰化，DNA与核心组蛋白体解聚。Gene 表达被激活
去乙酰化：抑制 gene表达
组蛋白的磷酸化:对组蛋白 H1 磷酸化，抑制基因表达 其他组蛋白
8 中心法则
Section E 1 DNA复制：细胞中，一条双链DNA分子通过碱基配对，形成两条与其序列相同的DNA双链分子的过程。2
确定DNA半保留复制
半不连续复制 3 复制的基本步骤 复制为双向
大肠杆菌的复制：
起始AT含量高的区域
参与蛋白：DnaA（复制起始因子)：识别并结合于重复序列上，驱使富含AT的重复序列解链，需负超螺旋，及ATP
DnaB(DNA解旋酶):DNA双链解旋，形成复制叉
SSB:(单链结合蛋白):保持解旋部分的单链状态
DnaG(引发酶/引物酶):RNA引物合成，引发复制 延伸
参与蛋白：DNA Pol III全酶：负责新链的合成:前导链，冈崎片段
DNA pol
I：复制中除去引物，填补引物处空缺
终止：
4 真核生物的复制：
一个细胞周期内，一个DNA分子只能复制一次
Section F 1 复制忠实性的机制：
DNA复制的高精度：模板连和进入核苷酸在DNA聚合酶的作用位点正确配对
3’到5’外切核酸酶对错误碱基的校正
错配修复 2 holiday模型 3
Section K
1 编码链 模板链 2 大肠杆菌的转录
RNAP酶：核心酶：a 亚基：aNTD对核心酶的组装很重要。
ACTD在识别启动子、调节转录水平中起着非常重要的作用。
B 亚基：RNAP的催化中心。
与模板DNA、RNA产物、及底物核糖核苷酸紧密结合。
抗生素利福平结合在在b 亚基上，可以抑制RNAP的转录活性。
利福平只抑制转录的起始。
利迪链菌素只抑制延伸而不抑制转录起始
B’ 亚基：可能与RNAP的催化有关。
肝素与b’亚基结合后，能干扰RNAP与DNA的结合，抑制转录。
w 亚基：可能与RNAP的组装及维持RNAP结构的稳定性有关
S factor(s因子)：s factor 在启动子特异性识别过程中至关重要 移动慢的原因：可以保持与翻译同步。
与有些基因转录调控相关。
有利于转录终止
RNAP没有3’ →5’外切酶活性，不能进行转录校正。其错配率达10-4。RNAP倒退暴露新合成的错配碱基，可以有利于其他辅助核酸酶将错配碱基切除，增加转录的忠实性。
3 s70基础启动子的一般结构
-10 序列：它对转录起始时，RNAP打开DNA双链的过程非常重要。-
10序列到TSS位点的距离对转录效率也有很大的影响-35 序列：增强RNAP s factor 的识别能力及与DNA的结合能力 4 影响启动子效率的DNA序列：
核心启动子的序列：与保守序列越像，效率越高。
TSS周围序列：影响起始效率。
转录单位的前30个核苷酸的碱基序列：影响RNAP从启动子处移动出去（启动子区清空）的速率。
核心启动子附近的调控元件。
5 转录的起始：开放复合物 闭合复合物 无效起始
延伸：启动子的清空，链的延伸转录泡，s因子的循环利用
终止：依赖性 不依赖性
反复重复序列
Section L 1.顺式作用元件（cis-acting elements）：一般为DNA上较为保守的、有着特异性序列或结构的特定区域。它们只能影响与其在同一条染色体上的基因的活动。如：启动子，转录激活因子结合位点等。
反式作用基因/调节基因（trans-acting genes，regulator genes）
可以影响与他们不在同一条染色体上的基因的表达水平的DNA元件。2 乳糖操纵子
3 色氨酸操纵子
4 正负调控都可以有诱导和阻遏两种调控方式。
正控诱导：诱导因子活化激活因子，使其可以增加基因的表达。（Lac operon，CRP调控）正控阻遏：共阻遏物使激活因子失活，减少基因的表达。负控诱导：诱导因子使阻遏蛋白失活，增加基因的表达。（Lac operon，lac repreor）负控阻遏:共阻遏物活化阻遏蛋白，使其可以降低基因的表达。（Trp operon，trp repreor）
Section M
1 增强子 沉默子
2 TFIID：可与多种核心启动子元件或特异性转录因子结合，启动二类转录预起始复合物组装的通用转录因子。
TBP(TATA-box binding protein):可识别并结合TATA-box TAFII（TBP-aociated factor II）：TBP关联蛋白，TFIID中与TBP形成复合体的所有蛋白，～13个。
TFII H的结构与功能：蛋白激酶(4 个亚基)：催化蛋白磷酸化。将NTP（一般为ATP）的g-磷酸基团转移到蛋白上。
磷酸化 RNA pol II 中的CTD 结构域。TFIIE 刺激TFIIH介导的磷酸化反应。DNA 解旋酶/ATPase(5 亚基)：
水解ATP，利用其能量打开DNA的双链
3 TBP(TATA-binding protein): 确保 RNA Pol I能正确定位到转录起始区域上。
SP1 为组成性表达的转录因子，在所有的细胞中都存在，与基因本底表达水平有关 SL1，选择因子,RNA Pol I起始转录所必需的因子 CTD:羧基末端结构域，的磷酸化状态与转录进程有关
转录起始时期，CTD结构域一般处于去磷酸化形式，与结合启动子有关。
转录延伸时期，CTD结构域常处于磷酸化形式，与mRNA的加工有关。
Section N 1 DNA-binding domains（DBD）:DNA结合结构域
螺旋-转角-螺旋结构（域）
锌指结构（域）
碱性结构（域）
Dimerization domains：二聚体化结构域
亮氨酸拉链 螺旋 散环 螺旋 DBD+DM 激活结构域 酸性激活结构域 富含谷氨酰胺结构域 富含脯氨酸的结构域 LBD
Section O
1 真核生物中mRNA 加工的一般过程 5’加帽: CTD作用：转录起始时，参与加帽反应的三种酶结合在RNA Pol II的CTD结构域上。转录产物刚开始合成时，即对其5’端进行加帽反应。
作用：防止降解：核糖核酸酶一般不能降解帽结构中的三磷酸键
帮助转运mRNA到细胞质中
增强翻译水平：mRNA需要帽结合蛋白的帮助才能更好的与核糖体结合帮助去除pre-mRNA中的第一个内含子。3’加Poly(A)尾：
作用：防止被核酸酶降解：增加mRNA的稳定性
有助于mRNA从细胞核到细胞质的转运
参与pre-mRNA的最后一个内含子的剪接。
增强mRNA的翻译水平，增加基因的表达 剪接 甲基化 2 核酶有：有催化功能的RNA即为核酶
U2 U6 RNAP 3 RNA的多样性：可变加工，反式剪接，RNA编辑
4 原核生物核糖体
真核生物核糖体
5 原核rRNA 加工的大致过程：形成多个茎环结构，与蛋白结合形成RNP，核苷酸修饰，逐级切割
真核rRNA 加工的大致过程：甲基化，切割。内含子剪接
6 原核tRNA 加工的大致过程:将多顺反子前体切割，分离出单顺反子前体
单顺反子前体进一步被切割，形成与成熟tRNA长度一致分子（RNases D, E, F，P
.碱基修饰，形成成熟tRNA 真核tRNA 加工的大致过程：5’-末端成熟，3’-末端成熟（添加5’-CCA-3’）去除内含子 7 miRNA and siRNA的调控机制：mRNA降解，抑制翻译，抑制转录
Section P 1 遗传密码的特性:
蛋白的编码信息由三联体密码子组成。
密码子为连续的，之间无间隔、无重叠。
除三个终止密码子之外，每个密码子对应一种氨基酸
有密码简并现象。即：多个密码子对应同一种氨基酸。
标准遗传密码子在各类生物中基本通用，不过少数生物体或细胞器中，有一些密码子对应的氨基酸与标准的不同。
生物对同义密码子的使用经常有偏好性。不同生物的密码子偏好性不同。
基因一般不重叠。一段核酸分子一般只有一个开放阅读框（open reading frame, ORF/可读框），被翻译成一个蛋白。
有些物种也有重叠基因的现象。
2 开放阅读框:ORF 从起始密码子ATG 到终止密码子
TGA,TAA or TAG 之间的连续的蛋白编码序列
CDS 编码序列 当ORF可以预测一个蛋白时 3 tRNA 二级结构:三叶草结构 4 tRNA的特异性加载：（翻译的高保真性）
氨酰-tRNA合成酶对相应tRNA分子有很强的专一性：第二密码子：
氨酰-tRNA合成酶接受相应氨基酸时有很强的忠实性：校正：双筛选机制—酶的活性中心，酶中的编辑位点
5 氨酰-tRNA（AA-tRNA）： 3’-end加载了一个氨基酸的tRNA分子。是在蛋白质合成中，将密码子转换氨基酸的适配器。
Section Q 1 密码子与反密码子的反向互补配对
2 一个tRNA可识别的密码子数由反密码子的第一位碱基决定
摆动学说：第三位密码子与第一位反密码子的配对可以摆动
反密码子第一位为A或C时，配对无摇摆现象。3 核糖体的E，P，A位点 A位：接受AA-tRNA部位.除了起始氨酰-tRNA，其他所有AA-tRNA都只能进A位点。P位：肽酰基-tRNA结合部位。起始氨酰-tRNA也进入此位点。E位：空载tRNA离开核糖体的位点。4 核糖体各亚基的功能
核糖体小亚基功能：结合mRNA
促进密码子与反密码子的正确结合mRNA移位
大亚基的功能A位、P位、肽酰转移酶（转肽酶）中心等在大亚基上。
负责携带AA-tRNA、肽键/肽链的形成 5 翻译的基本内容 核糖体与mRNA结合氨酰tRNA逐个进入核糖体
氨酰tRNA通过反密码子与mRNA互补配对 氨酰tRNA分子的氨基酸之间形成肽键。空载tRNA的释放 肽链的释放